快訊｜中國科學家“體外”獲得功能性精子
前言：
中國科學家終于成功在“體外”獲得了小鼠的功能性精子！為了達到這個目的，研究人員巧妙地將小鼠胚胎干細胞（ESC）誘導分化成功能性的精子（樣）細胞，借助輔助生殖技術產生了健康后代。這項工作2016年2月26日凌晨在線發(fā)表于干細胞權威雜志Cell Stem Cell 上[1]，為今后治療男性不育的臨床研究搭建了最為簡易而可行的平臺。
文 | 陳蘇仁（中國科學院動物研究所 助理研究員）
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在體外獲得有受精能力的生殖細胞一直都是生殖生物學和生殖醫(yī)學領域的難題和熱點。這項研究所建立的系統(tǒng)，能夠在體外“復制/模擬”體內精子發(fā)生過程，產生功能性精子樣細胞。先前的一些研究雖然也報道過成功從“干細胞”誘導分化產生了“生殖細胞”，但未充分評估獲得的生殖細胞的功能性。
近年來國際生殖生物學領域同行共同認為“減數(shù)分裂”是體外誘導形成精子樣細胞的最大障礙，并制定了確定人工獲得精子的功能性的“黃金標準”[2]。研究人員必須提供減數(shù)分裂特定時期的核DNA含量、染色體數(shù)目和各階段的染色體形態(tài)、精子樣細胞生產健康后代等有效證據(jù)。目前，達到所有以上指標（特別是完成減數(shù)分裂）仍然是在體外獲得功能性精子的最大考驗。
為克服這個壁壘，中國科學院動物研究所干細胞與生殖生物學國家重點實驗室的周琪院士、趙小陽研究員與南京醫(yī)科大學生殖醫(yī)學國家重點實驗室的沙家豪教授組成聯(lián)合研究團隊。第一步，將小鼠胚胎干細胞（ESC）誘導分化成原始生殖細胞樣細胞（PGCLC）；第二步，研究人員模擬原始生殖細胞（PGC）體內發(fā)育的“自然組織環(huán)境”，即與睪丸細胞共培養(yǎng)并添加性激素如睪酮等。最終，ESC來源的PGCLC擦除基因印跡，完成減數(shù)分裂，最終產生了功能性精子樣細胞，具備上述“黃金標準”，借助胞漿內單精注射（ICSI）產生健康后代（如下圖）。
今后，研究人員計劃在基礎研究和臨床治療兩方面將這項研究深入下去。一方面，利用這個系統(tǒng)體外研究調控減數(shù)分裂的分子機制；另一方面將檢測該系統(tǒng)是否適用于其他動物，特別是靈長類動物。當然，這項實驗室工作距離臨床治療還長路漫漫，可能的危險性必須排除，使用胚胎干細胞的倫理學問題也需要慎重考量。
輔助生殖技術能不能解決全部的男性不育問題？
不育癥是當今社會中較為常見的一類生殖健康疾病，困擾著全球范圍內約15%-20%的育齡夫婦，其中男性因素約占一半。男性不育病因復雜，許多遺傳與非遺傳因素均可致病，患者臨床多表現(xiàn)為非梗阻性無精子癥和少、弱、畸精子癥。精子的形成是一個復雜而連續(xù)的生殖細胞分化過程，它起始于原始生殖細胞（PGC）的遷移與增殖，經歷精原干細胞（SSC）的自我更新與分化、精母細胞減數(shù)分裂和精子變態(tài)等重要過程，最終產生“單倍體”功能性精子。
目前，試管嬰兒對于大眾并不陌生，但是借助這項技術使患有不育癥的男性成功當上父親還是有一個前提條件的——必須有“單倍體”精子。如果男性不育癥患者沒有“單倍體”精子，輔助生殖技術也束手無策?，F(xiàn)實中，的確有相當一部分男性不育癥患者經睪丸活檢沒有“單倍體”精子，僅存在早期發(fā)育階段的生殖細胞，如精原干細胞，部分精母細胞等，這些早期生殖細胞不是“單倍體”，無法直接用于輔助生殖。
從“干細胞（ESC）”到“原始生殖細胞樣細胞（PGCLC）”，再到“精子”
最早在2003年，Hans R. Scholer領導的研究組報道了小鼠胚胎干細胞（ESC）可體外經誘導分化產生卵子樣細胞。這項開創(chuàng)性研究隨即引發(fā)學術界的極大關注，因為干細胞居然能夠產生生殖細胞?!十多年后的今天，相關研究仍面臨一些主要的問題：精子發(fā)生是一個非常復雜的生理過程，其中僅有某些階段可體外“復制”。如前所述，很多研究并未證明人工產生的精子究竟是不是“真正的”精子。
可以說，日本科學家Saitou實驗室在方面做出了很大的貢獻。Saitou實驗室建立了胚胎干細胞（ESC）和誘導型多能干細胞（iPS）分化成為原始生殖細胞樣細胞（PGCLC）的黃金方法[3,4]。即先將ESC分化成外胚層樣細胞（EpiLCs），之后在生長因子或聯(lián)合過表達三種轉錄因子Blimp1、Prdm14和Tfap2c[5]下，約30%的EpiLCs誘導成為PGCLC。但是，PGC樣細胞無法繼續(xù)在體外完成減數(shù)分裂，需移植到青春期前受體小鼠睪丸曲細精管中，進行類“體內”精子發(fā)生，產生精子和卵子。使用相似方法，人ESC也可分化產生PGCLC[6]。
周琪、沙家豪、趙小陽團隊的這項研究，ESC來源的PGCLC真正完全在體外完成了減數(shù)分裂，最終產生了功能性精子樣細胞，借助輔助生殖技術產生了健康后代。不僅驗證了人工產生的精子是“真正的”精子細胞，而且不借助受體鼠睪丸曲細精管移植，完全在體外獲得了功能性精子，向ESC到精子的臨床治療又邁出了一步。
能否從不育癥患者睪丸少量樣本直接獲得單倍體精子？
基于胚胎干細胞存在很大的倫理學問題，科學家考慮能否直接通過微創(chuàng)手術獲得不育病人的一小塊睪丸組織樣本，通過體外培養(yǎng)方法直接獲得單倍體精子呢？一些研究人員已經在這方面有所嘗試。
例如2011年[7]日本科學家Ogawa研究團隊利用出生后幾天的小鼠睪丸組織小塊，置于瓊脂塊上，氣液聯(lián)合體外培養(yǎng)（添加許多生長因子）最終分化出了單倍體精子，經輔助生殖技術也獲得了健康后代。隨后[8] Ogawa研究團隊利用睪丸組織塊培養(yǎng)模型，將精原干細胞（SSC）也誘導產生單倍體精子，并產生了健康的后代。但該項技術效率極低，重復性也存在爭議。
2014年[9]上海交通大學仁濟醫(yī)院干細胞中心的何祖平教授研究團隊報道了隱睪病人（無單倍體精子）睪丸經消化并體外培養(yǎng)（添加RA和SCF等生長因子），可獲得單倍體圓形精子，通過圓形精子注射小鼠卵細胞（因為人的圓形精子注射人卵細胞不能發(fā)育）顯示受精卵具有一定發(fā)育潛能。但是，如何較為高效、穩(wěn)定地獲得功能性單倍體精子仍需大量的基礎與臨床研究。
參考文獻：
1.Zhou Q, Wang M, Yuan Y, Wang XP, Fu R, Wan HF, Xie MM, Liu MX, Guo XJ, Zheng Y, Feng GH, Shi QH, Zhao XY, Sha JH, Zhou Q. Complete meiosis from embryonic stem cell-derived germ cells in vitro. Cell Stem Cell 2016, Published online: February 25.
全文鏈接：http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(16)00018-7
2.Handel MA, Eppig JJ, Schimenti JC. Applying "gold standards" to in-vitro-derived germ cells. Cell 2014, 157(6): 1257-1261.
3.Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Aramaki S, Saitou M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell 2011, 146(4): 519-532.
4.Hayashi K, Ogushi S, Kurimoto K, Shimamoto S, Ohta H, Saitou M. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice. Science 2012, 338(6109): 971-975.
5.Nakaki F, Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Yabuta Y, Saitou M. Induction of mouse germ-cell fate by transcription factors in vitro. Nature 2013, 501(7466): 222-226.
6.Irie N, Weinberger L, Tang WW, Kobayashi T, Viukov S, Manor YS, Dietmann S, Hanna JH, Surani, MA. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell 2015, 160(1-2): 253-268.
7.Sato T, Katagiri K, Gohbara A, Inoue K, Ogonuki N, Ogura A, Kubota Y, Ogawa T. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature 2011, 471(7339): 504-507.
8.Sato T, Katagiri K, Yokonishi T, Kubota Y, Inoue K, Ogonuki N, Matoba S, Ogura A, Ogawa T. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications 2011, 2: 472.
9.Yang S, Ping P, Ma M, Li P, Tian RH, Yang H, Liu Y, Gong YH, Zhang ZZ, Li Z, He ZP. Generation of haploid spermatids with fertilization and development capacity from human spermatogonial stem cells of cryptorchid patients. Stem Cell Reports 2014, 3 (4): 663-675.
