又見張鋒：基因修飾技術(shù)再現(xiàn)新突破
?張鋒。 圖片來源: Stan Grazier
編者按：
“基因編輯技術(shù)領(lǐng)域的進展太快，感覺比現(xiàn)實中的時間要快數(shù)倍。”加州大學戴維斯分校的細胞生物學家Paul S. Knoepfler在《紐約時報》6月3日發(fā)表的報道中表示。此言不虛。上個月，河北科技大學的韓春雨剛剛顯著推進了編輯DNA的基因修飾技術(shù)：NgAgo。6月2日，華人科學家張鋒又宣布發(fā)現(xiàn)了一種編輯RNA的基因編輯工具CRISPR-C2c2，他表示，“ C2c2是‘CRISPR工具箱’研發(fā)中的里程碑。”“C2c2的應用前景具有多種可能性，我們很高興可以為生物醫(yī)學研究提供這一類工具”。
撰文 | 玉寶
責編 | 王承志 陳曉雪
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CRISPR-Cas系統(tǒng)用來編輯DNA的技術(shù)已非常成熟，成為全世界各大實驗室的主流基因編輯工具。最近，麻省理工學院博德研究所的核心研究員張鋒和其合作者證實，CRISPR也可以用來編輯RNA。
6月2日，《科學》（Science）雜志在線發(fā)文，報道了張鋒等人在CRISPR-C2c2這一RNA介導的RNA編輯系統(tǒng)方面的研究成果。
CRISPR-C2c2系統(tǒng)能夠根據(jù)靶向序列特異地編輯單鏈RNA。C2c2，全稱為Class 2 type VI-A CRISPR-Cas effector，同家族的Cpf1 (18), C2c1, and C2c3并無編輯RNA的功能。2015年12月，張鋒曾經(jīng)在《分子細胞》(Molecular Cell)發(fā)文，系統(tǒng)梳理過C2c2等四個核酸酶的功能。
CRISPR是一種半數(shù)細菌都具有的免疫系統(tǒng)。細菌可以借此抵御噬菌體和其它微生物的攻擊。學界使用廣泛的CRISPR-Cas9是專門靶向DNA的基因編輯系統(tǒng)。目前CRISPR領(lǐng)域的研究主要聚焦于改進編輯DNA的Cas9系統(tǒng)，研究RNA編輯系統(tǒng)的實驗室比較少。
C2c2是第一個被發(fā)現(xiàn)的靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)，2015年10月張鋒團隊即發(fā)現(xiàn)了這個特異的系統(tǒng)。C2c2來自一種纖毛菌 Leptotrichia shahii，含有HEPN結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域只存在于RNA酶中。這使研究人員猜測C2c2也具有RNA酶活性。他們在大腸桿菌中證明了這一點。
首先，他們將C2c2和針對某種RNA的噬菌體特異的間隔序列導入大腸桿菌中，然后用這種噬菌體感染細菌。噬菌體是一種可以感染并殺死細菌的病毒。實驗發(fā)現(xiàn)，細菌可以良好地生長，這說明噬菌體的RNA被降解了。如果將間隔序列換成了別的序列，則細菌會被噬菌體感染而無法正常生長。如果將C2c2的HEPN結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的區(qū)域突變掉，會使細菌喪失對噬菌體的抵抗性。體外的生化實驗也表明C2c2具有RNA酶活性，而且依賴于HEPN結(jié)構(gòu)域。
C2c2的RNA酶的關(guān)鍵位點已經(jīng)被找到，其引導RNA的結(jié)構(gòu)也可以被設計。這使得C2c2可以被改造成良好的RNA編輯工具。例如，將其酶活性位點突變后，C2c2可以結(jié)合特定RNA而不能切割它，這可以使研究人員可以方便地使用熒光標記想要研究的RNA。并且C2c2系統(tǒng)具有高通量的特點，可以更廣泛地用于基礎研究，并推動對人類復雜性狀疾病的發(fā)病機制研究。
C2c2這個RNA酶的發(fā)現(xiàn)，開拓了CRISPR系統(tǒng)的應用范圍。它可以用來標記、修飾、和剪切細胞中的RNA。經(jīng)過一系列實驗，張鋒團隊證明 C2c2可以剪切單鏈RNA，并且可以直接在細菌活體內(nèi)做剪切；但C2c2剪切不了雙鏈RNA。
研究人員還發(fā)現(xiàn)了C2c2另外一個有趣的特性：當其將靶序列剪切后，它對非靶序列的其它RNA序列也有一定的降解功能。敏銳的研究人員發(fā)現(xiàn)了這一點后，認為細菌可能存在不同于CRISPR系統(tǒng)的RNA免疫系統(tǒng)。這是下一步研究的方向和重點。而對于需要精確編輯RNA的工具來說，這個特性未來需要被克服。
基因敲降（gene knockdown）工具當中，目前應用最廣泛的是RNA干擾技術(shù)。未來該技術(shù)有可能被C2c2這類RNA編輯系統(tǒng)取代。C2c2系統(tǒng)具有更高的特異性和敲降效率。它具有兩個主要優(yōu)勢：
1. C2c2是一個2元件組成的CRISPR系統(tǒng)，只需要設計起引導作用的RNA序列即可。
2. C2c2基因本身可以被轉(zhuǎn)錄和翻譯，預示著細胞或細菌中可以做C2c2基因的轉(zhuǎn)基因。
目前CRISPR基因編輯工具越來越完善和齊全了。CRISPR-Cas9對細胞中基因組的遺傳改變可以永久性的，而CRISPR- C2c2卻可以臨時改變相應基因的調(diào)控和表達。C2c2系統(tǒng)由于需要28nt的序列做引導，比前者具有更高的特異性；同時，C2c2系統(tǒng)具有更多的基因編輯功能，可以操縱RNA的功能和翻譯，也可以用于高通量篩選，制作生物芯片等。
“ C2c2是‘CRISPR工具箱’研發(fā)中的里程碑”，在麻省理工學院的新聞中，張鋒自我評價道，“C2c2的應用前景具有多種可能性，我們很高興可以為生物醫(yī)學研究提供這一類工具”。值得期待的是，C2c2這個工具的發(fā)現(xiàn)，將有助于生物學家研究RNA在細胞中的精細功能，也有助于人類疾病發(fā)病機理的研究。
參考文獻：
1.O.O. Abudayyeh et al., “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,” Science, doi:10.1126/science.aaf5573, 2016.
2.Broad Institute. “New CRISPR system for targeting RNA” ，June 2, 2016
http://news.mit.edu/2016/new-crispr-system-targeting-rna-0602
3.Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems
http://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(15)00775-3.pdf
4.Scientists Find Form of Crispr Gene Editing With New Capabilities，http://www.nytimes.com/2016/06/04/science/rna-c2c2-gene-editing-dna-crispr.html?_r=1
