NgAgo研究有新進(jìn)展，和韓春雨撤回的研究有關(guān)系嗎？
美國普渡大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)作為 DNA 核酸內(nèi)切酶的活性 | CREDIT：Kevin Solomon/Purdue University
自河北科技大學(xué)副教授韓春雨及合作者2019年5月在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志發(fā)表NgAgo可能作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯工具以來，科學(xué)界關(guān)于NgAgo是否真的能夠進(jìn)行基因組編輯的討論就沒有停止過。因?yàn)闊o法重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這篇廣受爭議的論文在發(fā)表一年3個(gè)月后即被作者撤回，不過一直有科學(xué)家試圖了解NgAgo和其它Argonaute家族蛋白是否真的有替代CRISPR系統(tǒng)作為基因編輯工具的潛力。
2021年9月3日，普渡大學(xué) Kevin Solomon 團(tuán)隊(duì)在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）雜志報(bào)道的最新進(jìn)展顯示：他們確實(shí)看到了NgAgo作為 DNA 核酸內(nèi)切酶的活性，但這種活性和韓春雨之前報(bào)道的并不相同。
NgAgo的來源宿主是一種嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi ）。這類微生物生活在高鹽環(huán)境中，它們的蛋白在進(jìn)化中也適應(yīng)了這種極端環(huán)境，但在普通的低鹽環(huán)境中常常無法正確折疊。
在上述的研究中，研究人員也發(fā)現(xiàn)NgAgo在非嗜鹽宿主（如大腸桿菌）中表達(dá)量很低，且基本以不溶解的形式存在。即使在重折疊后，大多數(shù)NgAgo蛋白仍不能溶解且無活性。
但在細(xì)胞破碎的上清中，有少量以可溶形式存在的NgAgo蛋白。研究人員發(fā)現(xiàn)可溶的NgAgo在體外能夠切割質(zhì)粒和基因組DNA，而且這種活性可以不依賴于向?qū)NA（gDNA）。
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在有反義gDNA（與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)）存在時(shí)，絕大部分切割（>97%）發(fā)生在其對(duì)應(yīng)的DNA位點(diǎn)，而正義gDNA（與靶標(biāo)DNA序列相同）則不能引導(dǎo)NgAgo發(fā)生切割。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)NgAgo的切割活性是單鏈切割（Nicking），而非像Cas家族蛋白那樣的雙鏈切割。
進(jìn)一步地，研究人員發(fā)現(xiàn)NgAgo在大腸桿菌中可以在gDNA的幫助下實(shí)現(xiàn)基因編輯。這種編輯通常發(fā)生在gDNA 3' 末端外 1 nt 處切割靶向 DNA。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了NgAgo的切割活性結(jié)構(gòu)域PIWI對(duì)其在大腸桿菌的編輯能力是必要的。
這篇研究第一次在體外和體內(nèi)（大腸桿菌中）證實(shí)了NgAgo確實(shí)有DNA內(nèi)切酶活性，這對(duì)于理解NgAgo又前進(jìn)了一大步。之前的研究顯示NgAgo可以與靶基因結(jié)合以阻斷其轉(zhuǎn)錄，以及其可能有RNA編輯的活性，但沒有人在DNA上真正看到切割活性。
Argonaute家族一些蛋白的特性，例如不需要PAM序列，以及使用DNA而非RNA（容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)從而失效）作為向?qū)蛄?，可以彌補(bǔ)CRISPR基因編輯系統(tǒng)的很多不足，因而被生物學(xué)界寄予厚望。
科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其它Argonaute家族蛋白，如TtAgo，MpAgo，PfAgoa和MjAgo等確實(shí)有基因編輯活性，但都必須在55℃以上的高溫環(huán)境中才能工作，這使得科學(xué)家無法開發(fā)它們成為在細(xì)胞中工作的基因編輯工具。
NgAgo的天然宿主能夠在37℃生長，如果它能在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因編輯將會(huì)大大拓寬基因編輯工具箱的范圍。但后續(xù)的研究無一例外地發(fā)現(xiàn)，NgAgo在細(xì)胞中看不到基因編輯的活性。這將NgAgo這個(gè)明星分子推向風(fēng)口浪尖。
Kevin Solomon團(tuán)隊(duì)的這項(xiàng)研究，證實(shí)了NgAgo的DNA切割活性，這表明該蛋白可能有成為基因編輯工具的潛力。
但是，這并不代表韓春雨最初的論文結(jié)論被證實(shí)。
相反，這篇文章的實(shí)驗(yàn)基本否定了NgAgo在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因編輯的可能性。
首先，NgAgo在生理鹽濃度條件下可溶性極差，因此在細(xì)胞中的可溶部分濃度很難達(dá)到基因編輯所需要的量。
其次，和Cas9等內(nèi)切酶相比，NgAgo缺乏DNA解旋酶活性，這極大影響了其編輯效率。因?yàn)闊o法解開雙螺旋，只有細(xì)胞基因組復(fù)制時(shí)NgAgo才有機(jī)會(huì)接觸到單鏈DNA，從而發(fā)揮內(nèi)切酶活性。在這項(xiàng)研究中使用的大腸桿菌細(xì)胞周期很短，基因組復(fù)制占比時(shí)間很長，因此能觀察到細(xì)胞內(nèi)編輯活性。對(duì)于哺乳動(dòng)物來說，很長的細(xì)胞周期會(huì)使NgAgo難以發(fā)揮編輯功能。
另外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色質(zhì)中的組蛋白會(huì)抑制NgAgo的活性。大腸桿菌中沒有組蛋白，這有利于NgAgo發(fā)揮作用。
基于這些原因，NgAgo不太可能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因編輯活性，這與之前很多的研究結(jié)果也相吻合。
這項(xiàng)研究將NgAgo的功能研究往前推進(jìn)了一大步，第一次證實(shí)了NgAgo的DNA內(nèi)切酶活性。至于NgAgo是否能被改造為適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯工具，還需要更多的探索。
作者簡介
王承志為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)博士，現(xiàn)任職于某創(chuàng)業(yè)公司。
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