看見(jiàn)神經(jīng)：從卡哈爾到現(xiàn)代神經(jīng)解剖學(xué) | 神經(jīng)專欄
? 大腦的擴(kuò)散核磁共振（diffusion MRI）
撰文 | 賈曉寧、李德康、李天昊、涂洪清（上?？萍即髮W(xué)）
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自人類擁有智慧以來(lái)，“認(rèn)識(shí)自身”就是我們一直試圖達(dá)到的、樸實(shí)又富有深刻哲學(xué)內(nèi)涵的目標(biāo)。追溯生命意識(shí)的起源和形成、揭示生命各項(xiàng)活動(dòng)的“靈性”的本質(zhì)，生命科學(xué)在此過(guò)程中逐漸誕生、成型。神經(jīng)科學(xué)，這一學(xué)科向智慧的根源的探求在這認(rèn)識(shí)自身的漫長(zhǎng)圖卷中如同丹砂青雘，既為基礎(chǔ)，又顯華美。
認(rèn)識(shí)大腦的現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)發(fā)源于19世紀(jì)末20世紀(jì)初。如同絕大多數(shù)的科學(xué)門類需要一個(gè)天才以及天才的理論來(lái)奠定基礎(chǔ)，神經(jīng)科學(xué)的正式確立離不開(kāi)偉大的病理學(xué)家、組織學(xué)家圣地亞哥·拉蒙-卡哈爾（Santiago Ramóny Cajal）的研究成果和理論。為此，卡哈爾被譽(yù)為“現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)之父”。
在神經(jīng)科學(xué)的研究中，最重要的技術(shù)就是成像觀察技術(shù)。人類只有借助不斷發(fā)展的觀測(cè)技術(shù)，更加細(xì)致地觀察到神經(jīng)系統(tǒng)的真實(shí)模樣，才能更好地理解它的功能、研究它的狀態(tài)。而神經(jīng)系統(tǒng)承載著至關(guān)重要的功能，決定了它是生命體中最復(fù)雜的、最難觀察的結(jié)構(gòu)。這也就導(dǎo)致了人類對(duì)神經(jīng)科學(xué)的研究，始終伴隨著標(biāo)記和成像等技術(shù)的發(fā)展而前進(jìn)。
? 圣地亞哥·拉蒙-卡哈爾
早在1873年，意大利科學(xué)家卡米洛·高爾基首創(chuàng)鉻酸鹽-硝酸銀染色法，將解剖獲得的組織中的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞體和突起染成棕黑色，而未被染色的細(xì)胞呈無(wú)色，易在光學(xué)顯微鏡下觀察、用手繪圖片記錄。這是人類最早的神經(jīng)科學(xué)觀察成像技術(shù)。這一染色方法也被命名為“高爾基染色法”。
? 卡米洛·高爾基
卡哈爾在同一時(shí)期也在積極開(kāi)展神經(jīng)組織的解剖、觀察和研究。他對(duì)高爾基染色法有所改進(jìn)，即換用了更高濃度的重鉻酸鉀、延長(zhǎng)了第二步硝酸銀浸泡暗處理的時(shí)間，從而獲得了更充分可靠的染色樣本。在高爾基心愛(ài)的Zeiss光學(xué)顯微鏡下（他任教于巴倫西亞大學(xué)期間受到的獎(jiǎng)勵(lì)，在他的自傳中他強(qiáng)烈表達(dá)了自己彼時(shí)的喜悅），憑借著自己高超的觀察能力和繪畫技藝，他完成了數(shù)百幅美觀、細(xì)致的神經(jīng)解剖學(xué)繪圖。這些繪圖后來(lái)長(zhǎng)期被用作教學(xué)的范本，直到現(xiàn)在仍然可以出現(xiàn)在教材的對(duì)應(yīng)章節(jié)中。
之所以說(shuō)卡哈爾是天才，絕不僅僅因?yàn)樗槍?duì)客觀事物細(xì)致入微的觀察以及嚴(yán)謹(jǐn)而認(rèn)真的記錄，更是因?yàn)樗麑?duì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能的理解和分析?？ü柎_定了若干個(gè)重要的規(guī)律，并且在研究中始終貫徹：
神經(jīng)系統(tǒng)由神經(jīng)元這樣的基本單位構(gòu)成，但在研究功能時(shí)，需要整體考慮各個(gè)結(jié)構(gòu)之間的相互作用；
神經(jīng)信號(hào)（卡哈爾的用詞是‘nervous current’）的傳導(dǎo)大多是單向的，由樹(shù)突到神經(jīng)元細(xì)胞體再到軸突；
神經(jīng)元之間是生理結(jié)構(gòu)上不連續(xù)的，神經(jīng)信號(hào)可以跨過(guò)這種不連續(xù)的結(jié)構(gòu)而傳遞下去。
基于這些規(guī)律，卡哈爾對(duì)于觀察到的解剖結(jié)構(gòu)如何發(fā)揮功能的過(guò)程也有詳盡的分析與猜想。下面是一個(gè)典型的例子。
? 上圖是卡哈爾繪制的脊椎動(dòng)物視神經(jīng)相關(guān)通路的圖片。在圖中，卡哈爾已經(jīng)繪制出了神經(jīng)之間不連續(xù)的結(jié)構(gòu)（后人命名為突觸），并且解釋了低等脊椎動(dòng)物（左圖）和高等脊椎動(dòng)物（右圖）在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)組織結(jié)構(gòu)上不同的原因。
后人在更先進(jìn)的技術(shù)以及更精密的儀器支持下，證明了卡哈爾的結(jié)論正確性。作為染色方法真正的發(fā)明人的高爾基在同一時(shí)期提出了截然不同的結(jié)論，即神經(jīng)聯(lián)結(jié)成為網(wǎng)絡(luò)，沒(méi)有單向傳導(dǎo)、生理不連續(xù)的特征。直到1906年二人都因?yàn)樵谏窠?jīng)科學(xué)領(lǐng)域的巨大貢獻(xiàn)被授予諾貝爾獎(jiǎng)。當(dāng)他們站到頒獎(jiǎng)臺(tái)上的那一刻，分歧仍然沒(méi)有彌合?？ü柺切疫\(yùn)的，他得到了更接近事實(shí)的結(jié)論，所以被譽(yù)為了“神經(jīng)科學(xué)之父”，但高爾基也沒(méi)有被歷史遺忘，更多人所熟知的細(xì)胞器——高爾基體，正是以他的名字命名的。
高爾基銀染法是跨時(shí)代的，但不足以支撐對(duì)神經(jīng)元更深入、更細(xì)致的研究，染色的方法既不能揭示神經(jīng)纖維之間的聯(lián)系，也不能界定特定神經(jīng)元的完整分布區(qū)域，多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的軸突、樹(shù)突交叉在一起時(shí)，很難判斷一段神經(jīng)纖維屬于哪一個(gè)或哪一群胞體；況且切片后的神經(jīng)組織難以觀察到完整的神經(jīng)元。在如此艱難的情況下，也無(wú)怪乎高爾基把神經(jīng)當(dāng)做連接起來(lái)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)了。
科學(xué)永不止步，卡哈爾憑借其天才的觀察力和想象力，從粗陋設(shè)備獲得的模糊數(shù)據(jù)得出了精確的結(jié)論。
20世紀(jì)70年代以來(lái)，一種新型的利用神經(jīng)示蹤劑（tracer）觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的方法逐漸發(fā)展起來(lái)。注入在神經(jīng)細(xì)胞附近的示蹤劑會(huì)被神經(jīng)元特異性吸收，示蹤劑在神經(jīng)元內(nèi)依靠細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能擴(kuò)散到神經(jīng)元的各個(gè)角落，以此達(dá)到示蹤的目的。順行示蹤劑（anterograde tracer）在細(xì)胞內(nèi)順著信息流的方向擴(kuò)散，也就是在胞體部位注射示蹤劑，示蹤劑向神經(jīng)末梢傳遞；逆行示蹤劑（retrograde tracer）與之相反——在神經(jīng)末梢部位注射，示蹤劑逆信息流方向傳遞。
然而傳統(tǒng)示蹤劑并不是完美的。人們認(rèn)為，理想的示蹤劑需要具備如下五點(diǎn)特性：第一，它能特異性且高效得被神經(jīng)元細(xì)胞吸收；第二，它能靶向一類特定的動(dòng)力蛋白，表現(xiàn)出特異地順行或逆行傳導(dǎo)；第三，它的信號(hào)可視化且能夠被穩(wěn)定地放大；第四，其可應(yīng)用多種顏色以便使用多種示蹤劑；第五，一些示蹤劑可以信號(hào)不衰減地跨突觸傳遞。
? 不同示蹤劑的注射方法
嗜神經(jīng)病毒是一類可以感染神經(jīng)細(xì)胞，且能沿神經(jīng)環(huán)路增殖傳播的病毒。20世紀(jì)末，人們已經(jīng)開(kāi)始改造并利用這類病毒的疫苗株作為全新的示蹤劑，且一直沿用至今，成為了目前最高效的一類示蹤劑。
嗜神經(jīng)病毒在細(xì)胞特異性、示蹤效率、跨突觸示蹤方面顯著優(yōu)于傳統(tǒng)示蹤劑。特別是近年，在反向遺傳學(xué)和同源重組基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展下，人們對(duì)病毒示蹤劑的運(yùn)用更加靈活和廣泛。在疫苗株的基礎(chǔ)上，改造病毒基因組，敲除特定毒力基因，插入熒光蛋白等外源基因，獲得低毒力、安全、攜帶標(biāo)示物的重組示蹤工具病毒。
根據(jù)病毒示蹤劑能否擴(kuò)增從而跨突觸標(biāo)記，可分為兩大類。不能跨突觸的病毒示蹤劑又可根據(jù)病毒的種類分為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等，適合作為表達(dá)外源基因的載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒會(huì)將基因組整合進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞基因組，表達(dá)穩(wěn)定長(zhǎng)效；但是滴度與其他病毒相比略低。腺相關(guān)病毒滴度高、表達(dá)穩(wěn)定長(zhǎng)效、幾乎無(wú)毒，且可以用同源重組進(jìn)行編輯，是實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的一類；缺點(diǎn)是能夠攜帶的外源基因較小，長(zhǎng)度在4.8kb左右。腺病毒滴度高、感染迅速，也同樣可以運(yùn)用重組編輯；但病毒的衣殼蛋白會(huì)引起炎癥反應(yīng)。
能夠跨突觸的病毒示蹤劑常使用的主要有兩類，分別是皰疹病毒和彈狀病毒。這類病毒因?yàn)楸Ａ袅瞬《镜膹?fù)制能力，相應(yīng)地，其擁有快速的感染能力和不小的毒性。皰疹病毒最常用的是逆行示蹤的偽狂犬病毒（PRV）的Bartha strain和順行示蹤的α-皰疹病毒HSV-1 strain H129。
傳統(tǒng)示蹤劑和普通的病毒示蹤劑無(wú)法解決的一個(gè)問(wèn)題是示蹤劑無(wú)法特異性地選擇指定神經(jīng)元。于是人們?cè)诎捳畈《臼聚檮┥鲜状问褂昧薈RE-LoxP系統(tǒng)加以實(shí)現(xiàn)。2001年，DeFalco等利用了CRE-dependent PRV實(shí)現(xiàn)了選擇性標(biāo)記特異類型神經(jīng)元的輸入環(huán)路，使得病毒只能從指定神經(jīng)元開(kāi)始逆行示蹤。但PRV的缺點(diǎn)在于，無(wú)法感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物神經(jīng)。于是人們采用彈狀病毒來(lái)完成對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究。彈狀病毒主要有逆行示蹤的狂犬病毒（RV）和順行示蹤的水泡型口炎病毒（VSV）兩類。
普通跨突觸病毒示蹤劑用神經(jīng)元細(xì)胞存活時(shí)間來(lái)判斷級(jí)聯(lián)關(guān)系，然而考慮到細(xì)胞的自身特性和病毒的劑量，且伴隨著時(shí)間的流逝，神經(jīng)通路的復(fù)雜性使得判斷變得不夠準(zhǔn)確。Wickersham等利用RV疫苗株Sad B-19構(gòu)建了能夠?qū)崿F(xiàn)跨單突觸的示蹤劑。該示蹤劑同樣用到了Cre-LoxP重組技術(shù)和AAV病毒載體等工具，為現(xiàn)代復(fù)雜神經(jīng)環(huán)路示蹤等神經(jīng)科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
? RV病毒跨單突觸示蹤技術(shù)設(shè)計(jì)草圖
對(duì)病毒示蹤劑的開(kāi)發(fā)還遠(yuǎn)沒(méi)有結(jié)束，未來(lái)的方向?qū)⒕劢褂诮档投拘?、更多基因編輯和探尋多樣性的?shí)驗(yàn)物種材料入手。
神經(jīng)科學(xué)工作者一直想要實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)是知道于某個(gè)特定的時(shí)刻、在某個(gè)特定的區(qū)域，大腦具體發(fā)生了什么。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，神經(jīng)示蹤技術(shù)自然必不可少，但即便具有了發(fā)展較完備的各類神經(jīng)示蹤劑，以及病毒等可作用于活體的示蹤技術(shù)，想要看穿大腦，仍存在一個(gè)重要的問(wèn)題亟待解決：那就是我們觀測(cè)的高等生物的腦組織是不透明的，正如我們平時(shí)吃的腦花，都是白乎乎的。
這意味著光信號(hào)難以在樣本深處傳入和傳出。尤其是采用多聚甲醛固定的樣品，即便使用先進(jìn)的雙光子顯微鏡，固定樣品也只能成像到約300微米左右的深度[v]。面對(duì)難題，除了不斷研發(fā)性能更加先進(jìn)的顯微成像技術(shù)外，科學(xué)家們給出的另一個(gè)解決辦法是“把整個(gè)大腦變透明”，也即“透明腦技術(shù)”。
近年來(lái)研究者開(kāi)發(fā)了數(shù)種透明腦技術(shù)，列舉兩例：一是日本理化學(xué)研究所發(fā)育生物學(xué)中心（RIKEN）研發(fā)的，利用一種果糖水溶液（SeeDB），浸泡已固定的腦組織或胚胎樣本數(shù)日，研究人員便可以結(jié)合雙光子顯微鏡，觀測(cè)到小鼠腦結(jié)構(gòu)固定標(biāo)本毫米級(jí)的深度。
?透明腦，圖自 RIKEN
這是因?yàn)闃悠返牟煌该餍跃科湓蚴怯晒馕蘸凸馍⑸鋬刹糠衷斐桑诔上癫溉閯?dòng)物樣品時(shí)光的散射為主要不透明原因。而高濃度的蔗糖溶液此前已有被用來(lái)減輕腦和無(wú)脊椎動(dòng)物的樣品的光散射的案例，SeeDB更進(jìn)一步，利用果糖水溶液更高的光學(xué)折射率（1.502 at 37 °C，86.7% wt/wt, ~130% wt/vol），此折射率接近白質(zhì)中阻礙透光性的脂質(zhì)，故使用SeeDB不僅使得腦白質(zhì)的不透明能清除更為徹底，也避免了此前使用蔗糖溶液時(shí)會(huì)出現(xiàn)的樣品收縮和耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)樣品損壞等缺點(diǎn)。SeeDB可以做到保留錐體神經(jīng)元、樹(shù)突棘等精細(xì)結(jié)構(gòu)。
另一個(gè)透明腦技術(shù)為斯坦福的CLARITY技術(shù)，他們的策略更加“簡(jiǎn)單粗暴”——研究人員選擇直接用透明材料替換脂質(zhì)來(lái)消除不透明性。他們使用丙烯胺單體溶液浸泡樣品，直到丙烯胺單體完全浸潤(rùn)組織深處。然后稍稍加熱到體溫附近，使得單體發(fā)生聚合反應(yīng)，構(gòu)成的聚丙烯胺凝膠高分子網(wǎng)絡(luò)能夠有效支撐組織，此時(shí)使用去污劑等完全抽離細(xì)胞結(jié)構(gòu)中原本的脂質(zhì)，就得到了由透明的聚丙烯胺水凝膠支撐的腦組織樣本，結(jié)合神經(jīng)示蹤技術(shù)即可獲得腦組織深處的圖像。
? 圖自http://clarityresourcecenter.org
CLARITY除了可以用于神經(jīng)組織外，也可以被擴(kuò)展利用到其他需要實(shí)現(xiàn)透明化組織，已被實(shí)現(xiàn)的有肺(Joshi, 2015; Saboor, 2015)、肝(Font-Burgada,2015)甚至完整個(gè)體/胚胎 (Epp, 2015;Yang, 2014)。
基于觀測(cè)技術(shù)的發(fā)展和觀測(cè)數(shù)據(jù)的積累，科學(xué)家建立數(shù)據(jù)庫(kù)以保存和交流這些觀察到的數(shù)據(jù)和圖像，一個(gè)著名的腦神經(jīng)科學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)是ALLEN BRAIN ATALS（阿蘭腦圖譜），ABA基于基因組學(xué)和神經(jīng)解剖學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建了小鼠和人的腦部基因表達(dá)地圖，使得研究者能方便的利用已有的研究數(shù)據(jù)去定位某個(gè)神經(jīng)元的投射位置和方向以及相應(yīng)基因的表達(dá)情況。
縱觀神經(jīng)解剖學(xué)發(fā)展的歷程，我們能看到伴隨著時(shí)間軸并進(jìn)的另外幾條發(fā)展脈絡(luò)：
一是觀察的結(jié)果由粗糙到細(xì)致?？ü柕某晒诎倌昵翱芍^是不可思議般的精妙；但百年之后的今日，即便不是專業(yè)研究者，也會(huì)認(rèn)為卡哈爾時(shí)代的銀染法所繪制的神經(jīng)圖案是較為粗糙的。給出這種評(píng)判的自信正是源于這百年間各類示蹤技術(shù)的發(fā)展和成像手段的進(jìn)步，使我們對(duì)結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果開(kāi)始具有相當(dāng)高度的要求。我們今日的掃描成像及重構(gòu)技術(shù)已經(jīng)可以精確地描述突觸以及更小的神經(jīng)細(xì)胞的次級(jí)結(jié)構(gòu)，倘若再經(jīng)百年，又會(huì)是何情形？
二是觀察的范圍從小到大?？ü柈?dāng)時(shí)所能觀察的樣品大小為其銀染范圍所限，是局部而缺損的。如今的透明腦等技術(shù)的發(fā)展，使得我們能夠?qū)σ粋€(gè)完整的組織樣本甚至個(gè)體樣本進(jìn)行細(xì)致的觀察，無(wú)疑使得神經(jīng)形態(tài)學(xué)的研究更加具有整體性。而Allen腦圖譜等數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，也使得各個(gè)局部的數(shù)據(jù)得到拼合，并能夠結(jié)合遺傳學(xué)等其他學(xué)科的研究?jī)?nèi)容。
三是觀察的對(duì)象從死到活。神經(jīng)科學(xué)不僅需要觀察已有的神經(jīng)形態(tài)，還需要觀察動(dòng)態(tài)的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，這就需要能夠在活體樣本中工作的成像技術(shù)。得益于不斷發(fā)展的各類示蹤技術(shù)和顯微成像手段，我們已經(jīng)能夠觀察活體樣本的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程。更一步的，將超微結(jié)構(gòu)的成像做到動(dòng)態(tài)化則是我們寄希望于不遠(yuǎn)未來(lái)能夠?qū)崿F(xiàn)的理想。
神經(jīng)解剖學(xué)是觀察和記錄的學(xué)科，可以說(shuō)是作為筑于其上的、對(duì)發(fā)育和功能的研究的根基；而再在其上，又會(huì)有基于神經(jīng)科學(xué)的各項(xiàng)交叉學(xué)科，如認(rèn)知科學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)工程學(xué)以至心理學(xué)。
想要寫作首先要會(huì)理解、想要理解首先要會(huì)閱讀、而想要閱讀我們需要能夠看見(jiàn)，作為諸學(xué)科根基的神經(jīng)解剖學(xué)所做的正是實(shí)現(xiàn)“看見(jiàn)”、“看清”這么簡(jiǎn)單卻無(wú)比重要的目標(biāo)。因?yàn)榭匆?jiàn)，所以向前——基礎(chǔ)的進(jìn)步抬升學(xué)科的前沿，前沿的突破又帶來(lái)基礎(chǔ)的發(fā)展，科學(xué)就是這樣一種螺旋上升、永不停止的文明之階。
制版編輯：常春藤丨
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