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一種比恐龍還古老的生物，幫助單堿基編輯擴充了“武器庫”

2019/08/17
導讀
這種“史前”美味，給單堿基編輯器的優(yōu)化帶來了希望。


- 編者按 -
 
毫無疑問，基因編輯是當前最為火熱的一個研究領域。這篇文章解釋了時下最為歡迎的基因編輯工具 CRISPR 的工作機制，并解釋了單堿基編輯器的出現(xiàn)為何是基因編輯領域的一個突破。

而對于單堿基編輯器來說，脫氨基酶決定其安全性和適用范圍。最近，仇子龍及其團隊從一種比恐龍還要古老的寄生生物身上得到靈感，通過篩選多樣化的胞嘧啶脫氨基酶，構(gòu)建出一系列新的胞嘧啶堿基編輯器（CBEs），使其安全性和適用范圍得到了優(yōu)化和拓展。
 
撰文 | 程田林

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寫在前面的話：DNA與基因


要了解基因編輯，需要對DNA與基因有充分的認識。我們裝修自己的房屋，需要有設計圖紙，根據(jù)圖紙來按部就班地完成裝修。形象一點而言，DNA就是人體的設計圖紙，人體怎樣搭建，全靠DNA指引。繪制房屋設計圖紙，最基本的便是兩種線條：直線，弧線；人體的設計圖紙DNA最基本的則是四種堿基：ATGC。房屋設計圖紙中，通過線條的組合，我們可以描繪出書房、廚房、臥室、餐廳等等；通過堿基的組合，我們可以設計出搭建人體所需要的各種蛋白質(zhì)及RNA，對應著蛋白質(zhì)及RNA的堿基組合便是基因；基因描繪的，其實就是人體的“書房”、“廚房”、“臥室”、“餐廳”等等。房屋設計圖紙出錯，我們可以通過橡皮或是修正液加以改正。基因出了錯，我們該如何改正？基因編輯工具就是負責修正基因的工具。為了改正房屋設計圖紙，我們希望能有更好用的橡皮或修正液，最好能安全無痕；我們不斷地開發(fā)優(yōu)化基因編輯工具，當然也是希望能安全無痕的改正出錯的基因。
 


一、CRISPR-Cas9系統(tǒng)的誕生


生物學研究可以看做是 “尋寶” 之旅，每名研究者都在尋找自己眼中的 “寶藏”。很多時候，預期的 “寶藏” 未能尋到，卻在不經(jīng)意間開啟了 “藏寶洞”。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)就是這樣的意外。
 
1987年，大阪大學的 Yoshizumi Ishino 及其同事正關注于大腸桿菌的iap基因，他們已經(jīng)完成了該基因的測序工作。按照莫諾&雅各布的乳糖操縱子理論，基因的上下游很可能有調(diào)控元件的存在（圖1A）。于是，Yoshizumi Ishino 也就順理成章地對iap基因的上下游序列進行了測序。只是，他們沒有尋找到預期的 “寶藏”——調(diào)控元件，而是發(fā)現(xiàn)了無法破解的密碼——五段重復的DNA序列。想象一下跨欄比賽的欄桿，研究者發(fā)現(xiàn)了五個欄桿（重復的DNA序列），欄桿之間是長度相同但序列不同的DNA片段（圖1B）。這種特征的序列是前無古人的，研究者很懵。當然，他們還是寫了文章，描述了這一奇怪的發(fā)現(xiàn)，但沒人知道這意味著什么 [1]。

 圖1. 乳糖操縱子基本結(jié)構(gòu)及CRISPR-Cas位點的發(fā)現(xiàn)歷程
 
到了二十世紀九十年代，測序技術不斷進步，研究者們在微生物的基因組中不斷發(fā)現(xiàn)類似的特征序列，當然，依舊無人知曉這些序列的秘密。2002年，烏得勒支大學的 Ruud Jansen 團隊決定重新分析這類序列，看看是否能“挖寶”。
 
首先，這類序列有了名字，叫做 “規(guī)律成簇的間隔短回文重復”（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。CRISPR 的名號自此而始。他們還發(fā)現(xiàn)，CRISPR 序列可以轉(zhuǎn)錄成 RNA；而且序列附近似乎總是有類似的基因相伴，于是這些基因就叫做Cas（CRISPR-associasted），Cas編碼的蛋白能切割 DNA（圖2）[2]。至此，CRISPR-Cas 系統(tǒng)成型，但它存在的意義依然是一片空白。
 
后來，研究者發(fā)現(xiàn)，CRISPR 序列跟某些噬菌體（這是一種感染細菌的病毒）基因組的部分序列很匹配。至此，細菌與噬菌體被聯(lián)系在了一起。此時，進化生物學家 Eugene Koonin入場：他整合了關于 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的所有碎片化信息，指出，CRISPR-Cas 系統(tǒng)是細菌的免疫系統(tǒng)，是細菌對抗病毒的武器 [3]。
 
進化生物學家做完預測就已經(jīng)完成任務。不過聽者有意。微生物學家Rodolphe Barrangou 很喜歡這個理論，就去設計實驗加以驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn) Koonin 的理論竟然是對的！也就是說，被噬菌體感染后，細菌會通過 CRISPR-Cas 系統(tǒng)切割噬菌體的基因組以保留證據(jù)；如果細菌能僥幸存活，面對同樣的噬菌體感染時，它們就能利用已有的證據(jù)消滅噬菌體以保護自己 [4]。
 
此時，CRISPR-Cas 系統(tǒng)的功能基本確定，但具體的細節(jié)依然有待研究。此時關鍵人物 Jennifer Doudna 與 Emmanuelle Charpentier 入場，正是她們的研究讓我們明白了 CRISPR-Cas 系統(tǒng)抵御外敵入侵的詳細機制，也讓基因編輯成為了可能。具體而言，這一機制可分為三步：
 
第一步是Cas蛋白復合物對外敵DNA的識別，保留證據(jù)（長度為30-50bp的外敵DNA（被稱作原型間隔序列））在自己的基因組（CRISPR位點）中（圖2，步驟1-2）。
 
第二步是 CRISPR 位點的轉(zhuǎn)錄，最終形成兩條短鏈的 crRNAs（CRISPR來源的RNAs）和 tracerRNA（反式作用的crRNA）。其中 crRNAs 負責攜帶外敵信息，這是 CRISPR-Cas 系統(tǒng)識別并對抗外敵入侵的基礎（圖2，步驟3）。
 
第三步是清除入侵的外敵 DNA。如果 CRISPR-Cas 系統(tǒng)是武器，前兩步好比武器零件的制造，這一步就是武器的組裝：Cas9 蛋白、crRNA 和 tracerRNA 組成整體，其中 crRNA 好比瞄準鏡，精確制導，Cas9 蛋白則像一把剪刀，去剪斷被鎖定的外敵 DNA（圖2，步驟4-5）。[5-6]
 
圖2 CRISPR-Cas抗病毒的基本原理（來自www.scienceinschool.org）。
 
大家都欣喜若狂！CRISPR-Cas 系統(tǒng)能清除外敵 DNA，是因為 crRNA 的序列與外敵 DNA 序列匹配。如果改變瞄準鏡 crRNA 的序列，使之匹配其它物種的基因組序列，豈不是指哪打哪？
 
經(jīng)過不斷的優(yōu)化，指哪打哪的 CRISPR-Cas9 武器真的誕生了（圖3）[7]。
 
圖3 CRISPR-Cas9基因編輯技術的基本原理（J.D.Sander etal. 2014）
 


二、DNA單堿基編輯器的誕生


最開始，CRISPR-Cas9 是剪刀，剪斷 crRNA 瞄準的基因組位點。但是，兩把剪刀不嫌多，有三把更好。研究者們各顯神通，“魔改” 系統(tǒng)，將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)打造成了十八般武器：比如，剪刀太鋒利，就把剪刀磨鈍，只讓 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)負責定位或是在基因組上留下缺口，而不要完全切斷基因組；要想調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，就給鈍剪刀加上轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器；要想精修基因組，就給鈍剪刀加上各樣的修剪器。
 
我們都知道，DNA 序列是由四種不同的堿基組成，通過不同的排布，便可以儲藏豐富的信息。如果有特定的堿基改變，其儲藏的信息也會發(fā)生改變。那么，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)能否被改造成精準改變特定堿基的武器？細胞內(nèi)有一類酶，叫做堿基脫氨基酶，其中有兩種，一是胞嘧啶脫氨基酶，它可以讓胞嘧啶（C）變成尿嘧啶（U），而U在基因組中會被替換成胸腺嘧啶（T），從而能實現(xiàn)堿基的改變（C->T）（圖4A）；另一類是腺嘌呤脫氨基酶，它可以讓腺嘌呤（A）變成次黃嘌呤（I），在基因組中I發(fā)揮鳥嘌呤（G）的功能，從而能實現(xiàn)堿基的改變（A->G）（圖4B）。
 
而將磨鈍的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)與脫氨基酶組合，研究者獲得了可實現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)換的新武器——單堿基編輯器（Baseeditors，BEs）。介導 C->T 改變的被稱為胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）[8]，而介導A->G改變的被稱為腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）[9]。不過單堿基編輯器有兩大問題，一是瞄準鏡的范圍小，有的位置瞄不到；二是有脫靶，不小心會改變其它位置的堿基，從而引發(fā)安全風險 [10]。
 
圖4 脫氨基酶與堿基轉(zhuǎn)換（改自H.A.Rees etal. 2018）
 


三、單堿基編輯器的深度演化


要改造優(yōu)化單堿基編輯器，更換不同的脫氨基酶是可行的策咯。CBE 系統(tǒng)中常用的脫氨基酶分別來自大鼠的 APOBEC1，人的 AID1 和七鰓鰻的 PmCDA1，它們有著相似的編輯范圍。自然界是否還有另類的脫氨基酶存在？這需要深入挖掘。
 
在挖礦一般的查找文獻和數(shù)據(jù)庫后，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心研究員仇子龍及其團隊發(fā)現(xiàn)，七鰓鰻中有著相當多樣的胞嘧啶脫氨基酶（圖5）[11]，值得深入探索。

圖5 三種七鰓鰻中的胞嘧啶脫氨基酶及大鼠APOBEC1和人源AID的序列比對（Cheng et al.2019）
 
七鰓鰻，是一種比恐龍還要古老的寄生生物，它們在地球上的生存時間已經(jīng)超過3.6億年。作為寄生生物，七鰓鰻有吸血狂魔的惡名（圖6）。在美食家眼中，七鰓鰻卻又享有盛名：它的美味曾經(jīng)讓英王亨利一世無法自拔，并最終吃的太多，腹脹而死。

圖6 七鰓鰻的卡通圖及實物圖
 
這樣一種 “史前” 美味，給單堿基編輯器的優(yōu)化帶來了希望。
 
七鰓鰻會表達多種不同的胞嘧啶脫氨基酶，而且不同種的七鰓鰻所含的酶功能各有差異 [11]。這些多樣化的酶與 CRISPR/Cas 系統(tǒng)組合后極大的拓展了 CBEs 的活性范圍，這讓瞄準范圍更廣，極大地豐富了單堿基編輯的工具箱。如同樂高積木一樣，通過不同的組合策略，我們獲得了一系列的 CBEs，它們有著不同特色的瞄準鏡，使得活性范圍更加多樣化，從而有著不同的適用場景，這讓工具箱中的CBE 工具更加豐富，在使用上也有了更大的選擇余地（圖7）[12]。此外，新添加的 CBE 工具在安全性上也有了明顯的改善，這為單堿基編輯技術的應用提供了更多選擇，新的胞苷脫氨酶也為未來單堿基編輯工具的開發(fā)和改善提供了基礎。
 
圖7：CBE系統(tǒng)的分類（Cheng et al. 2019）CBE 系統(tǒng)的活性窗口定義為 sgRNA 中編輯效率>40%的C位點。（a）前置型CBE（FSCBEs），其活性窗口主要位于sgRNA靶位點的前端（PAM位點看作最末端）。（b）后置型 CBE（BSCBEs），活性窗口主要位于 sgRNA 靶位點的后端。（c）廣譜型 CBE（BRCBEs），活性窗口橫跨 sgRNA 靶位點的前后端。
 
單堿基編輯技術有著相當廣泛的應用（圖8），它在動物模型的構(gòu)建、疾病治療、作物育種以及點突變篩選等等多個方面都極具潛力 [13]。開發(fā)安全性高、適用范圍廣的單堿基編輯工具將有助于其潛力的兌現(xiàn)，從而更好的服務于生物醫(yī)學研究。新的 CBE 工具在安全性和適用范圍上均取得了相當大的進步，為單堿基編輯技術的進步做出了貢獻。
 
圖8 單堿基編輯技術的應用前景 （改自K.A.Molla et al. 2019）

作者簡介

程田林博士，助理研究員，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心，中國科學院神經(jīng)科學研究所

 
參考文獻：
1. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., and Nakata, A. (1987).Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphataseisozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.J Bacteriol 169, 5429-5433.
2. Jansen, R., Embden, J.D., Gaastra, W., and Schouls, L.M. (2002). Identificationof genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 43, 1565-1575.
3. Makarova, K.S., Grishin, N.V., Shabalina, S.A., Wolf, Y.I., and Koonin, E.V.(2006). A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes:computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functionalanalogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. BiolDirect 1, 7.
4. Marraffini, L.A. (2015). CRISPR-Cas immunity in prokaryotes.Nature 526, 55-61.
5. Doudna, J.A., and Charpentier, E. (2014). Genome editing. The new frontier ofgenome engineering with CRISPR-Cas9. Science346, 1258096.
6. Hsu, P.D., Lander, E.S., and Zhang, F. (2014). Development and applications ofCRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell157, 1262-1278.
7. Sander, J.D., and Joung, J.K. (2014). CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol 32, 347-355.
8. Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A., and Liu, D.R. (2016).Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage. Nature 533, 420-424.
9. Gaudelli, N.M., Komor, A.C., Rees, H.A., Packer, M.S., Badran, A.H., Bryson,D.I., and Liu, D.R. (2017). Programmable base editing of A*T to G*C in genomicDNA without DNA cleavage. Nature 551,464-471.
10. Rees, H.A., and Liu, D.R. (2018). Base editing: precision chemistry on thegenome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet.
11. Holland, S.J.,Berghuis, L.M., King, J.J., Iyer, L.M., Sikora, K., Fifield, H., Peter, S.,Quinlan, E.M., Sugahara, F., Shingate, P.,et al. (2018). Expansions, diversification, and interindividual copy numbervariations of AID/APOBEC family cytidine deaminase genes in lampreys. Proc NatlAcad Sci U S A 115, E3211-E3220.
12. Cheng, T.-L., Li, S., Yuan, B., Wang, X., Zhou, W., and Qiu, Z. (2019).Expanding C–T base editing toolkit with diversified cytidine deaminases. NatureCommunications 10, 3612.
13. Molla, K.A., andYang, Y. (2019). CRISPR/Cas-Mediated Base Editing: Technical Considerations andPractical Applications. Trends Biotechnol.

制版編輯 | 皮皮魚


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