最后的戰(zhàn)役：六年堅(jiān)持，終于修成正果
“有些時(shí)候覺(jué)得自己應(yīng)該堅(jiān)持下去。假如是在距離成功還差一步之遙的時(shí)候功虧一簣了，可能以后再面臨類似的困難時(shí)，就再也沒(méi)有戰(zhàn)勝它的信心了。”
撰文 | 黃宇翔
編輯 | 金莊維
絕望（2017.1-2018.4）
讓我們簡(jiǎn)單回顧一下，截至2016年年底，許悅的科學(xué)故事包含了哪些內(nèi)容：
首先，SebX是細(xì)菌的一個(gè)具有ADP核糖轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白，可以抑制宿主細(xì)胞的異源自噬通路激活；
其次，宿主細(xì)胞的V-ATPase能招募ATG16L1，進(jìn)而觸發(fā)異源自噬的通路。
以上的第一句話是說(shuō)，許悅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的細(xì)菌效應(yīng)分子，這個(gè)效應(yīng)分子進(jìn)到細(xì)胞里會(huì)搞破壞，導(dǎo)致宿主細(xì)胞不能再有效地將入侵者標(biāo)記為“有害垃圾”進(jìn)行清除；
第二句話是說(shuō)，許悅揭示了宿主細(xì)胞對(duì)付“有害垃圾”的一套全新通路。
這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)，假如單獨(dú)整理出來(lái)，其實(shí)已經(jīng)足夠在一流的學(xué)術(shù)期刊上發(fā)出兩篇漂亮的文章了。
不過(guò)邵峰團(tuán)隊(duì)素來(lái)以追求完美著稱，一項(xiàng)研究不做到盡善盡美，絕不會(huì)輕易發(fā)表。而在許悅的工作中，整個(gè)邏輯鏈條的扣合，還差最后一枚關(guān)鍵的拼圖。
相信聰明的讀者們也和當(dāng)時(shí)的許悅一樣，已經(jīng)看出整個(gè)故事所欠缺那枚拼圖了：SebX是如何發(fā)揮酶活性，抑制宿主細(xì)胞的異源自噬通路的呢？也就是說(shuō)，許悅那個(gè)時(shí)候還不知道，細(xì)菌的效應(yīng)分子SebX究竟是怎么在細(xì)胞內(nèi)四處搞破壞的呢？
只有找出細(xì)胞內(nèi)SebX確切的底物，才能將整個(gè)故事講圓。
于是，在2017年的1月，許悅踏上了尋找SebX體內(nèi)底物的征途。
ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶對(duì)于邵峰實(shí)驗(yàn)室而言，是一個(gè)從未涉足過(guò)的領(lǐng)域。這意味著，一切都需要自己從頭摸索。
她首先刷遍了關(guān)于ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶的研究文獻(xiàn)，并且搜集梳理出幾乎所有與之相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法。在邵老師的支持下，她從公司訂購(gòu)試劑、給相關(guān)實(shí)驗(yàn)室寫郵件借實(shí)驗(yàn)材料，嘗試了多種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶底物的方法。
許悅采用的各種檢測(cè)方法比較一致的基本思路是，將ADP-核糖基團(tuán)帶上特殊的標(biāo)記（例如同位素、生物素），使得被ADP-核糖基修飾過(guò)后的蛋白可以被常用的生物學(xué)手段檢測(cè)到。
經(jīng)過(guò)辛苦的摸索試錯(cuò)，這些檢測(cè)方法在許悅手上，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照結(jié)果終于都已經(jīng)能做到近乎完美了。
但在細(xì)胞內(nèi)，她使盡渾身解數(shù)，仍無(wú)法檢驗(yàn)到SebX的底物。
到了2017年9月，已經(jīng)進(jìn)入博士第六個(gè)年頭的許悅開(kāi)始感到了畢業(yè)的壓力。她的科學(xué)故事截止到此其實(shí)已經(jīng)足夠精彩，即使沒(méi)有找出SebX的底物，也足夠?qū)⑦@個(gè)工作發(fā)在不錯(cuò)的雜志上了。
但鳳非梧桐不棲，固執(zhí)的許悅相信這一發(fā)現(xiàn)的重要性，不甘心就此放棄。
“有些時(shí)候覺(jué)得自己應(yīng)該堅(jiān)持下去。假如是在距離成功還差一步之遙的時(shí)候功虧一簣了，可能以后再面臨類似的困難時(shí)，就再也沒(méi)有戰(zhàn)勝它的信心了?！痹S悅?cè)绱嘶貞浤嵌渭灏镜臅r(shí)光。
但一次又一次的陰性結(jié)果，意志再堅(jiān)強(qiáng)的人也會(huì)陷入深深的自我懷疑當(dāng)中。
“我有時(shí)候會(huì)很害怕，擔(dān)心陰性的結(jié)果背后不是檢測(cè)手段的局限，而是自己真的想錯(cuò)了，”許悅解釋說(shuō)，“我檢測(cè)的方法都是SebX催化蛋白質(zhì)的ADP-核糖基修飾，但如果細(xì)胞中不是這樣的呢？畢竟此前有研究報(bào)道ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶是可以將ADP-核糖與非蛋白小分子共價(jià)連接，比如在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域大家都比較熟知的SIRT2，它催化組蛋白去乙酰化，將ADP-核糖基團(tuán)與乙?；噙B。如果SebX催化的結(jié)果是對(duì)非氨基酸類的小分子的修飾，那我的實(shí)驗(yàn)手段就是錯(cuò)誤的。一次次的陰性結(jié)果讓我擔(dān)心自己真的是在南轅北轍?！?/p>
許悅的顧慮是，她所有的實(shí)驗(yàn)方法都基于SebX修飾的底物是蛋白質(zhì)這一基本假設(shè)。但假如大自然跟她開(kāi)了個(gè)玩笑，SebX在細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際底物是非蛋白小分子，那么她就是再堅(jiān)持下去也是不可能做出結(jié)果的。
在2017年年底一次向邵老師的討論工作時(shí)，許悅再一次呈現(xiàn)了擁有完美對(duì)照組SebX底物檢測(cè)的陰性結(jié)果，她表現(xiàn)出深深的焦慮。這時(shí)候，邵老師安慰她。
“我們已經(jīng)把能想到的方法都試過(guò)了，也許因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)的局限性，這可能不是一個(gè)現(xiàn)在能回答的科學(xué)問(wèn)題?！鄙劾蠋煹统恋纳ひ纛D了頓，“我不能替你做決定你應(yīng)該什么時(shí)候選擇放棄，也許你應(yīng)該設(shè)定一個(gè)deadline。”
震驚，沮喪，絕望，無(wú)助。在休息區(qū)的沙發(fā)上，她內(nèi)心中積累的壓力在此刻被一齊釋放了出來(lái)。
這次崩潰過(guò)后，許悅又嘗試了幾種方法，依然都只有陰性結(jié)果。已經(jīng)進(jìn)入到博士第六年的許悅，在尋找SebX底物的同時(shí)也開(kāi)始著手整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、撰寫文章。
2018年4月10日，邵老師認(rèn)真修改后將這份帶著些許遺憾的文章投到了《細(xì)胞》雜志。
一個(gè)月后，他們接到了《細(xì)胞》雜志編輯的拒稿郵件。
三個(gè)審稿人中，審稿人1比較認(rèn)可此項(xiàng)研究，但也看出了文章在邏輯上沒(méi)有扣上的漏洞，希望回答SebX是如何抑制異源自噬的；
另外兩位審稿人則對(duì)于許悅提出的新模型非常抵觸，給出了非常負(fù)面的評(píng)價(jià)意見(jiàn)。
可能由于先入為主的觀念的影響，后兩位審稿人對(duì)于文章看得并不是很細(xì)致，一位審稿人甚至弄混了文章中在細(xì)菌上做的轉(zhuǎn)座子遺傳篩選和在真核細(xì)胞上做的CRISPR遺傳篩選。
饋贈(zèng)（2018.4-2018.5）
期望落空，總在眾望所歸之處；
期望?，F(xiàn)，總在心灰意冷之時(shí)。
《終成眷屬》 威廉·莎士比亞（1564-1616）
但就在接到《細(xì)胞》雜志拒稿的第二天，SDS-PAGE蛋白膠上的一條17kDa的條帶，讓許悅精神大振。而這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的來(lái)源，則要追溯到將近一年前在北生所的一場(chǎng)學(xué)術(shù)報(bào)告。
2017年6月，北生所的董夢(mèng)秋老師邀請(qǐng)瑞士蘇黎世大學(xué)的Michael Hottiger教授在所內(nèi)作報(bào)告，報(bào)告的內(nèi)容是用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究真核細(xì)胞中的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶。
在報(bào)告中，Hottiger教授提及他實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出了能高效結(jié)合ADP-核糖的改造蛋白AF1521以及實(shí)驗(yàn)室自制的抗體。
邵老師給Hottiger教授寫郵件索要試劑，起初Hottiger教授還有幾分顧慮（文章至今沒(méi)有發(fā)表），但邵老師詳細(xì)介紹了課題與實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮?，他非?？犊靥峁┝诵量喔脑斓谋磉_(dá)AF1521的質(zhì)粒以及識(shí)別ADP-核糖的抗體。
但由于一些曲折并且不可控的因素，在2018年4月底，許悅才正式收到Hottiger教授的提供的珍貴質(zhì)粒。她利用改造后的AF1521去富集細(xì)胞中ADP-核糖修飾的蛋白，然后用Hottiger教授提供的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。當(dāng)拿到顯影的結(jié)果后她立刻喜上眉梢：相比對(duì)照組，異源自噬通路抑制的實(shí)驗(yàn)組在分子量為17kDa附近多出了一條明顯的條帶。這意味著運(yùn)用Hottiger教授提供的試劑，那個(gè)許悅苦苦尋找而不得的細(xì)胞內(nèi)SebX修飾底物千呼萬(wàn)喚始出來(lái)了。
終于獲得了能捕捉SebX修飾底物的工具，就距離把這個(gè)底物找出來(lái)不遠(yuǎn)了！
圖6. 17kDa的條帶。發(fā)現(xiàn)SebX作用底物的原始數(shù)據(jù)：使用Michael Hottiger贈(zèng)送的試劑，許悅發(fā)現(xiàn)細(xì)菌自噬抑制組相比對(duì)照組在分子量17kDa附近有一個(gè)條帶，后續(xù)的化學(xué)分析表明這正是被SebX修飾的靶蛋白ATP6V0C。
不過(guò)在技術(shù)上，想要精確地鑒定出ADP-核糖修飾的位點(diǎn)，在質(zhì)譜學(xué)方面還存在一些技術(shù)性的困難。
此時(shí)，質(zhì)譜學(xué)科班出身的程森加入了這個(gè)團(tuán)隊(duì)。
強(qiáng)援（2018.5-2018.12）
程森的合作參與要從2017年10月的一場(chǎng)虛驚說(shuō)起。
許悅在邵峰老師實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)了非常良好的文獻(xiàn)習(xí)慣，會(huì)定期在網(wǎng)絡(luò)上檢索和自己課題相關(guān)的最新進(jìn)展。比如說(shuō)，她在谷歌學(xué)術(shù)網(wǎng)站就設(shè)置了“異源自噬”等關(guān)鍵詞，以防錯(cuò)過(guò)了領(lǐng)域內(nèi)重要的最新進(jìn)展。
2017年的十月，她偶然看到了北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院劉小云課題組在一篇質(zhì)譜學(xué)專業(yè)期刊發(fā)表的研究，這項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)另一個(gè)沙門氏菌株系所分泌出的蛋白進(jìn)行組學(xué)分析，鑒定出了一個(gè)編號(hào)為STM1239的全新效應(yīng)分子，并將其命名為SopF，意思是沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)的編號(hào)為F的效應(yīng)分子[7]。
許悅在NCBI上搜索了SopF的基因序列——劉小云團(tuán)隊(duì)鑒定出的SopF，與她苦心經(jīng)營(yíng)鉆研數(shù)年的SebX完完全全是同一個(gè)基因。
2017年10月，正是她苦苦尋找SebX底物而不得，壓力最沉重的時(shí)期。
邵老師建議許悅在第一時(shí)間向劉小云老師發(fā)送郵件，解釋自己在三年半以前獨(dú)立鑒定出了這個(gè)基因在異源自噬通路中的作用，并來(lái)到北大向劉小云老師和那篇文章的第一作者介紹了自己的研究?jī)?nèi)容以及存在的困境。
程森就是那篇為SopF命名的質(zhì)譜學(xué)研究的第一作者，2014年入學(xué)北京大學(xué)前沿交叉科學(xué)學(xué)院的一名博士研究生。
因此，當(dāng)許悅在2018年5月看到了那條17kDa條帶之后，邵老師主動(dòng)聯(lián)系劉老師，希望在質(zhì)譜方面富有經(jīng)驗(yàn)的程森可以共同參與到這一課題中。
程森首先將整條泳道的條帶切下，制備出做第一次質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的樣品——初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADP-核糖修飾發(fā)生在V-ATPase復(fù)合物中ATP6V0C亞基上。
帶有ADP-核糖修飾的ATP6V0C，就是許悅在蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)中觀察到的17kDa片段——其中，ATP6V0C分子量約為16 kDa，ADP-核糖分子量為541Da。
可是，如何才能找到SopF是在哪個(gè)位點(diǎn)對(duì)ATP6V0C進(jìn)行修飾的呢？
一般的接受生物學(xué)訓(xùn)練的研究者，只會(huì)將樣品送到儀器中心，按照標(biāo)準(zhǔn)流程檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果顯示失敗，只能無(wú)奈地發(fā)出一聲鞭長(zhǎng)莫及的嘆息。
但當(dāng)時(shí)，程森在劉小云實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)積累了四年和質(zhì)譜儀打交道的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)質(zhì)譜儀的各種參數(shù)都很熟悉，因此能根據(jù)自己樣品的特性調(diào)節(jié)質(zhì)譜儀檢測(cè)的參數(shù)。經(jīng)過(guò)幾次摸索，程森首先將ADP-核糖的修飾位點(diǎn)縮小到了一串“GTAQQPR”七肽序列上，進(jìn)而再接再厲，推斷出修飾發(fā)生在ATP6V0C第124個(gè)位點(diǎn)的谷氨酰胺上。
許悅立刻對(duì)海拉細(xì)胞ATP6V0C基因第124號(hào)位的谷氨酰胺做了點(diǎn)突變，最終證明該位點(diǎn)對(duì)于介導(dǎo)異源自噬通路的必要作用。
最后一塊拼圖終于完美插入進(jìn)來(lái)，現(xiàn)在整個(gè)故事的邏輯無(wú)懈可擊。
2018年12月20日，許悅順利完成了博士畢業(yè)答辯。
就在同一天，邵峰老師將修改好的文章重新投到了《細(xì)胞》雜志。
圖7. 鑒定ADP核糖修飾位點(diǎn)。程森通過(guò)質(zhì)譜學(xué)手段，檢測(cè)出SebX對(duì)ATP6V0C的ADP核糖修飾發(fā)生于第124位的谷氨酰胺。
尾聲（2018.12-2019.7）
我們實(shí)際上是打開(kāi)了兩個(gè)黑匣子，一個(gè)是發(fā)現(xiàn)并把一個(gè)功能未知的細(xì)菌效應(yīng)蛋白的作用機(jī)制搞清楚了，另一個(gè)是把細(xì)菌誘導(dǎo)激活的異源自噬通路闡明了，而打開(kāi)第一個(gè)黑匣子正是為打開(kāi)第二個(gè)黑匣子提供了可能（這也是為什么前人未能打開(kāi)第二個(gè)黑匣子的原因），這樣的研究路徑和思路是我自己覺(jué)得最酷和最有吸引力的地方。 邵峰
這一次，《細(xì)胞》雜志的編輯對(duì)許悅博士的研究心悅誠(chéng)服，除了將修改的文章重新發(fā)給了此前的三位審稿人，又邀請(qǐng)了第四位審稿人對(duì)這篇文章進(jìn)行評(píng)價(jià)。
此前提出在細(xì)菌效應(yīng)分子和宿主細(xì)胞互作方面存在漏洞的審稿人1在看到新增加的證據(jù)后，完全被說(shuō)服，給出了非常正面的反饋意見(jiàn)；
審稿人2和審稿人3對(duì)于文章提出的新模型提出了他們后續(xù)的問(wèn)題；
審稿人4給出了很積極的反饋。
在與審稿人幾次交鋒，根據(jù)審稿人要求完成了相應(yīng)需要補(bǔ)做的實(shí)驗(yàn)之后，這項(xiàng)工作最終在2019年6月3日被《細(xì)胞》雜志正式接收，2019年7月18日正式在線發(fā)表。許悅博士為文章的第一作者，周平博士為第二作者，程森博士為第三作者，邵峰老師為通訊作者，丁璟珒博士、劉小云博士和Michael Hottiger教授都位列在作者之席[8]。
圖8. 幾個(gè)值得紀(jì)念的時(shí)間點(diǎn)：
2018年4月10日，首次向《細(xì)胞》投稿，一個(gè)月后收到拒信；
2018年12月20日，許悅博士答辯，再次將文章送審；
2019年6月3日，文章被《細(xì)胞》正式接收；
2019年7月18日，文章正式在線發(fā)表。
由于劉小云課題組工作發(fā)表在前，因此邵峰老師團(tuán)隊(duì)放棄了原先SebX的名字，沿襲了此前報(bào)道中SopF的命名。
許悅博士目前以短期博后的身份繼續(xù)留在邵峰老師實(shí)驗(yàn)室從事她熱愛(ài)的科研工作，主要在整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，準(zhǔn)備著SopF故事相關(guān)的第二篇文章的投稿。
談及這項(xiàng)工作，許悅無(wú)不感慨：“讀博之前已做好經(jīng)受磨難的準(zhǔn)備，但當(dāng)困在其中久了之后，焦慮與不自信就慢慢占據(jù)了內(nèi)心?，F(xiàn)在回想起來(lái)，邵老師的指導(dǎo)、整個(gè)團(tuán)隊(duì)的合作與朋友們的關(guān)心最終幫助我度過(guò)了重重難關(guān)。邵老師說(shuō)過(guò)的幾句話還時(shí)常想起。
‘你現(xiàn)在最大的問(wèn)題是沒(méi)有自信。’課題處于探索性階段時(shí)，每次實(shí)驗(yàn)都抱有一點(diǎn)期望，但得到的往往都是陰性結(jié)果，邵老師對(duì)我說(shuō)的這句話瞬間就戳中了我的內(nèi)心。這個(gè)過(guò)程中自信在消減，慢慢就丟失了思考與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)力，最后很有可能就在不斷否定中放棄。
‘專注，是我們擁有最強(qiáng)大的武器。’現(xiàn)在的社會(huì)中，太多事情會(huì)分散我們的注意。每天打開(kāi)手機(jī)，各種資訊稀釋著我們的時(shí)間。唯有專注，才能比別人擁有更多的時(shí)間來(lái)解決真正有價(jià)值的問(wèn)題。
‘要保持獨(dú)立思考的能力。’這一點(diǎn)相信是每個(gè)科研工作者都認(rèn)同的事情，要做原創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，不能人云亦云，勇于挑戰(zhàn)權(quán)威。如果當(dāng)初邵老師接受異源自噬的主流觀點(diǎn)，那這個(gè)課題也就不復(fù)存在了。
這些品質(zhì)都是我在邵老師身上學(xué)習(xí)到的最有價(jià)值的財(cái)富，與大家共勉?！?/p>
最后再聊聊這個(gè)故事里的其他幾位主人公現(xiàn)在都在做什么吧。
周平博士在幫助許悅完成尋找異源自噬的CRISPR篩選之后，隨后又接著利用流式分選與CRISPR技術(shù)做了另一個(gè)篩選——找到ADP-heptose激活NF-κB通路的必需基因。有了之前積累的豐富經(jīng)驗(yàn)之后，這次篩選簡(jiǎn)直就是小菜一碟。只做了一次實(shí)驗(yàn)，就成功篩選到ALPK1與TIFA兩個(gè)關(guān)鍵基因。隨后他又證明ALPK1是ADP-heptose的受體，磷酸化TIFA激活NF-κB，這項(xiàng)工作在2018年順利發(fā)表在《自然》雜志上[9]。周平即將結(jié)束在邵峰團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)達(dá)7年的博后生涯，將在年底入職廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，建立自己獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室。
丁璟珒博士在2018年正式被提升為中科院生物物理所正研究員，目前繼續(xù)從事著對(duì)病原細(xì)菌感染的前沿研究；
至于整個(gè)故事背后的大Boss，北生所的邵峰老師，哈哈，就讓我們和“賽先生”一起，期待在未來(lái)從他實(shí)驗(yàn)室出產(chǎn)更多精彩的研究工作吧。
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致謝：
感謝許悅博士、周平博士接受“賽先生”的采訪，并對(duì)稿子中與事實(shí)偏離的錯(cuò)誤予以指正。
感謝邵峰老師百忙之中抽出時(shí)間對(duì)稿件真實(shí)性進(jìn)行審定。
感謝屠鑫明先生、劉時(shí)昱先生、馮莎莎女士、劉斯敏先生、蘇嘉昱先生、張任子墨先生、董明澤先生、鄭璞先生、范家豪先生與筆者所展開(kāi)的極具啟發(fā)性的討論。
參考資料
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