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30年前,這位華人學(xué)者對(duì)干擾素機(jī)制研究做出重要貢獻(xiàn)

2022/08/29
導(dǎo)讀
如今,在成千篇關(guān)于STAT的研究論文中,誰又能躲得過他發(fā)現(xiàn)的SH2結(jié)構(gòu)域呢!
    8.28
知識(shí)分子The Intellectual

1993年5月13日,傅新元在西奈山醫(yī)學(xué)院的辦公室中工作 | 受訪者供圖


 導(dǎo)   讀

上世紀(jì)九十年代,借著分子生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展的春風(fēng),細(xì)胞通路領(lǐng)域的研究迎來井噴的黃金歲月,一條條精妙的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被一一揭曉。其中,JAK-STAT通路無疑是其中一顆耀眼的明星——它的發(fā)現(xiàn),首次讓人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞表面的信號(hào)蛋白在被激活后能直接進(jìn)入細(xì)胞核,作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。與此同時(shí),這條通路在免疫系統(tǒng)中的重要作用,引發(fā)了相關(guān)靶向藥物開發(fā)的熱潮。
在JAK-STAT通路的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用中,華人科學(xué)家傅新元作出了開創(chuàng)性的貢獻(xiàn)。當(dāng)傅新元回憶起30年前參與的這一歷史性發(fā)現(xiàn)時(shí),他表示:生命科學(xué),在人類基因組計(jì)劃之前,基本上是通過小科學(xué)在推動(dòng)發(fā)展。從孟德爾和摩爾根開始,科學(xué)家個(gè)人,通過興趣和自己的智慧,首先提出科學(xué)假說(Hypothesis Driven),再通過一個(gè)個(gè)具體的科學(xué)實(shí)驗(yàn),證明或者否定此假說或者概念。以這種方式,逐步發(fā)展生命科學(xué)。基礎(chǔ)研究的成果可以進(jìn)一步應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)。 “和大科學(xué)不同,一個(gè)普通的,在一個(gè)小小實(shí)驗(yàn)臺(tái)上工作的科學(xué)家 (A Bench Scientist),就有可能在歷史的某一個(gè)節(jié)點(diǎn),做出重要科學(xué)貢獻(xiàn)?!?/span>

在JAK-STAT通路發(fā)現(xiàn)30周年之際,《知識(shí)分子》特約撰稿,回顧這一歷史性過程。


撰文 | 黃宇翔

責(zé)編 | 陳曉雪


 ●                   ●                    


 引  子 

1992年2月,紐約西奈山醫(yī)學(xué)院生化系實(shí)驗(yàn)室。

看著眼前的序列比對(duì),一道靈光在傅新元的腦中忽然閃現(xiàn)。

此時(shí)的傅新元,已經(jīng)在自己剛剛建立的實(shí)驗(yàn)室連續(xù)工作了三個(gè)月了。這三個(gè)月來,他每天住在實(shí)驗(yàn)室,工作至少17小時(shí),想搞清楚他在研究干擾素信號(hào)通路時(shí)發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)新的基因。這天,他終于發(fā)現(xiàn),這幾個(gè)基因編碼的蛋白中,存在著一些相似的序列,而這些序列又都屬于同一種名為 “SH2” 的結(jié)構(gòu)域。

“SH2” 結(jié)構(gòu)域(Src Homology 2 domain)最初由生物化學(xué)家 Tony Pawson 在1986年命名。他最早發(fā)現(xiàn)SH2結(jié)構(gòu)域在多個(gè)不同蛋白中存在,并且能夠?qū)R坏暮桶l(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)結(jié)合——特別是一部分細(xì)胞受體。由此,Tony Pawson 提出,SH2結(jié)構(gòu)域可能是介導(dǎo)信號(hào)通路傳遞的關(guān)鍵點(diǎn)。[1-4]

在傅新元發(fā)現(xiàn)的這幾個(gè)基因編碼的蛋白p84/p91和p113上,竟然也存在著類似的SH2結(jié)構(gòu)域。

“很可能就是這個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域,將細(xì)胞外的干擾素信號(hào)從被激活的干擾素受體傳導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞核!” 這個(gè)大膽的猜想令傅新元欣喜若狂。

幾天后,自己的序列比對(duì)結(jié)果后,傅新元一面向生化系同事 Ronald Kohanski 請(qǐng)教磷酸化修飾分析的經(jīng)驗(yàn),一面跟自己的博士后導(dǎo)師 James Darnell 分享了這則大膽的猜想:

“Jim,我終于找到我們發(fā)現(xiàn)的蛋白ISGF3傳導(dǎo)干擾素信號(hào)的機(jī)制了!”

對(duì)這一猜想,James Darnell 半信半疑,而傅新元卻信心十足、欣喜如狂,因?yàn)椋@個(gè)發(fā)現(xiàn),正如后來所證明的那樣,是開啟干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一把鑰匙,為整個(gè)領(lǐng)域的爆發(fā)奠定了基礎(chǔ)。



抉  擇
 01 

八十年代中期,隨著干擾素基因的克隆,圍繞干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究儼然成為一片富饒的金礦。

這個(gè)最初于1957年由 Alick Isaacs 和 Jean Lindenmann 兩位病毒學(xué)家命名的細(xì)胞因子,曾作為 “抗病毒的青霉素” 被寄予了厚望,但批量生產(chǎn)的不易限制了它的應(yīng)用(注1,注2)。[5]

而如今,一旦研究者在重組DNA技術(shù)的幫助下實(shí)現(xiàn)了重組人源干擾素大量生產(chǎn),這種神奇的細(xì)胞因子立刻就在臨床實(shí)踐中大展身手:抗病毒、抗腫瘤、甚至在治療一種名為多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis)的神經(jīng)退行性疾病的戰(zhàn)場上都能見到它的身影。[6]

可干擾素在臨床中大顯神威的背后,人們對(duì)于其作用機(jī)制仍然知之甚少。

這里有太多的重要問題等待研究者們?nèi)セ卮?。例如,在病毒的刺激下,?xì)胞為何能快速合成分泌出大量的干擾素?哈佛大學(xué)的 Tom Maniatis 和日本大阪大學(xué)的谷口維昭(Tadatsugu Taniguchi)向著干擾素上游的調(diào)控機(jī)制分別尋去,各自都有不菲的收獲。[7-9]

而在信號(hào)通路的下游,細(xì)胞又是如何對(duì)干擾素的刺激作出反應(yīng)的呢?

在這個(gè)問題的吸引下,兩位學(xué)者逐漸從各自熟悉的領(lǐng)域走出,向這一謎題發(fā)起挑戰(zhàn)。

James Darnell 常年在分子生物學(xué)領(lǐng)域耕耘,對(duì)RNA分子的剪切原理做出過重要的貢獻(xiàn),此時(shí)研究的興趣正向著基因表達(dá)調(diào)控的方向過渡。他首先嘗試通過cDNA文庫對(duì)肝臟細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因進(jìn)行分析,但失望地發(fā)現(xiàn)憑借當(dāng)時(shí)的技術(shù),肝細(xì)胞一旦分離后在體外培養(yǎng),會(huì)很快表現(xiàn)出與生理?xiàng)l件下十分不同的性質(zhì)。不可避免地,在肝細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)研究陷入了停滯。[10-12]

此時(shí),Darnell從前的同事 Pete Knight 所任職的杜邦公司生產(chǎn)出了大量的重組人源干擾素,而Darnell作為公司的科學(xué)顧問,恰有獲得大量廉價(jià)干擾素的便利條件(注3)。因此Darnell的博士后 Andy Larner 就開展了一個(gè)差異表達(dá)篩選實(shí)驗(yàn)。這位勤快的學(xué)者,從干擾素處理前后的海拉細(xì)胞(或人成纖維細(xì)胞)中分別提取、構(gòu)建cDNA文庫,期望用獲得的cDNA探針捕捉到海拉細(xì)胞受刺激后表達(dá)量升高的基因。[13]

就在 Andy Larner 將論文投稿到《美國國家科學(xué)院院刊》(PNAS)的前一個(gè)月,《細(xì)胞》收到了一篇研究方法非常類似的投稿。George Stark 指導(dǎo)的研究生 Richard Friedman,構(gòu)建了一個(gè)比 Andy Larner 制備的更大的干擾素應(yīng)答cDNA文庫,發(fā)現(xiàn)了更多受到干擾素刺激發(fā)生上調(diào)的mRNA類別。[14]

George Stark 是個(gè)地道的生化學(xué)家,在開發(fā)一個(gè)調(diào)控DNA核苷酸合成代謝酶的抑制劑PALA時(shí),意外觀察到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因增殖(gene amplification)的現(xiàn)象。1977年,他利用學(xué)術(shù)休假機(jī)會(huì)在老朋友Ian Kerr位于英國的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行訪問研究,陡然對(duì)干擾素的作用機(jī)制產(chǎn)生了濃厚的興趣。他和Kerr當(dāng)時(shí)猜測,一段名為 “2-5A”(2’,5’-oligoadenylates)的寡聚核苷酸鏈?zhǔn)墙閷?dǎo)干擾素影響基因表達(dá)的第二信使。


回到斯坦福后,Stark繼續(xù)與 Ian Kerr 圍繞干擾素展開合作,不久后干脆將實(shí)驗(yàn)室搬到了倫敦,與 Ian Kerr 一起探索細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路對(duì)干擾素刺激做出響應(yīng)的機(jī)理。[15]

但干擾素刺激究竟是如何引發(fā)下游基因的不同表達(dá)呢,其選擇性又如何決定?

這便是接下來等待他們?nèi)セ卮鸬目茖W(xué)問題。

 02 

尋找細(xì)胞因子與基因表達(dá)之間的聯(lián)系,突破口之一是從細(xì)胞膜表面上的特異性受體入手。克隆出相應(yīng)的受體,接著嘗試從與受體結(jié)合的蛋白中尋找線索,這便是一種 “自上而下” 的研究思路。

此時(shí)人們已經(jīng)在細(xì)胞膜表面鑒定出了能識(shí)別干擾素的受體,因此以蘇黎世大學(xué) Michel Aguet 和華盛頓大學(xué) Bob Schreiber 為代表的研究者,就計(jì)劃從干擾素受體的克隆出發(fā)向揭示干擾素的作用通路發(fā)起挑戰(zhàn)(注4)。[16,17]

但 George Stark 和 James Darnell 卻不約而同地想到了另一種 “自下而上” 解決問題的思路:當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)錄因子在基因調(diào)控中所發(fā)揮關(guān)鍵作用已經(jīng)得到了人們的廣泛認(rèn)可,因此一種很自然的假說就是干擾素是通過一些未知的轉(zhuǎn)錄因子刺激一系列抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

而通過前期的cDNA差異篩選篩選實(shí)驗(yàn),他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些在干擾素刺激下表達(dá)量大幅上升的基因。

聰明的讀者不難猜出他們的研究計(jì)劃:既然手中已經(jīng)掌握了一些受到干擾素刺激表達(dá)量會(huì)升高基因的信息,那有沒有可能將這些DNA序列當(dāng)作 “魚餌”,在細(xì)胞中釣取、純化出與之發(fā)生結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子呢?

James Darnell 實(shí)驗(yàn)室野心勃勃的博士后 David Levy,與充滿活力的研究生 Daniel Kessler 組成了一對(duì)極為高效的組合,他們從一個(gè)命名為ISG-54的基因中克隆出了啟動(dòng)子序列,發(fā)現(xiàn)如果將這段啟動(dòng)子序列 “嫁接” 到其他的基因上游,就能讓本與干擾素通路無關(guān)的基因在干擾素的刺激下大量表達(dá)。與此同時(shí),他們從同事那里得到了與ISG-54性質(zhì)相似的另一個(gè)命名為ISG-15的基因。比較ISG-54與ISG-15的啟動(dòng)子序列,他們發(fā)現(xiàn)了一段長度為15個(gè)堿基對(duì)的保守序列,將其命名為 “ISRE”(IFN-responsive element)(注5)。借助分子生物學(xué)的突變分析,他們確定ISRE序列對(duì)于ISG-54和ISG-15啟動(dòng)子在響應(yīng)干擾素刺激的能力上至關(guān)重要,據(jù)此推斷這很可能就是干擾素下游轉(zhuǎn)錄因子所結(jié)合的位置。[18,19]

他們向海拉細(xì)胞導(dǎo)入包含ISG-54片段的質(zhì)粒,并對(duì)其進(jìn)行干擾素刺激后,發(fā)現(xiàn)提取出的ISG-54在電泳時(shí)的移動(dòng)速率呈現(xiàn)出了三條不同的條帶,原因是結(jié)合了不同的蛋白復(fù)合物——他們將這三條條帶結(jié)合在ISG-54上的不同蛋白復(fù)合物分別稱作ISGF-1、ISGF-2和ISGF-3(圖1)。[20]

首先,他們發(fā)現(xiàn)無論是否有干擾素刺激,ISGF-1復(fù)合物都會(huì)與ISG-54片段結(jié)合,因此不太可能是干擾素信號(hào)通路的直接效應(yīng)分子。

而ISGF-2和ISGF-3都是在加入干擾素處理后才結(jié)合到ISG-54上,因此搞清楚ISGF-2和ISGF-3具體的成分是接下來的核心問題(注6)。

與此同時(shí),George Stark 實(shí)驗(yàn)室的 Richard Friedman 等人再接再厲,也從cDNA文庫中克隆出了6-16、1-8和9-27等基因的啟動(dòng)子序列,鑒定出其具有的ISRE序列,并且也通過DNA片段電泳速度的變化,找到了結(jié)合ISRE序列片段的蛋白復(fù)合物 “E因子”(E factor,E代表early的意思)。[21-23]

那么,ISGF-2、ISGF-3以及 “E因子” 的身份是什么呢?

破解這一謎題,一種直截了當(dāng)?shù)霓k法就是純化出足夠多的蛋白,對(duì)其組分逐一分離,基于氨基酸序列設(shè)計(jì)PCR引物實(shí)現(xiàn)最終的克隆。

但這一利用生物化學(xué)方法純化蛋白所需的巨大工作量,讓 George Stark 和 James Darnell 的研究者們面面相覷,紛紛望而卻步。

這時(shí),一位雄心勃勃的生物化學(xué)家按響了 James Darnell 的門鈴,毛遂自薦去承擔(dān)這一史詩般的任務(wù)。他,就是傅新元,一位來自中國的毛頭小伙。

1988年初,傅新元正式登上了干擾素研究的歷史舞臺(tái)。

圖1 圖中的B1、B2和B3指的就是ISGF1、ISGF2、ISGF3與ISG54 DNA 片段形成的復(fù)合物的電泳條帶 | 圖源[20]



突  破
 01 
傅新元從小就是個(gè)精力充沛、桀驁不馴的人。

15歲時(shí)對(duì)西方思想史的閱讀,促使他將 “探索人類思想的主流” 立為自己的人生目標(biāo)。中學(xué)畢業(yè)后,傅新元來到江蘇淮安的一所公立學(xué)校做老師。一次進(jìn)城逛書店,二手書架上一本內(nèi)部翻譯的《重組DNA》論文集激發(fā)了他對(duì)于現(xiàn)代生物學(xué)的興趣。

1977年高考恢復(fù)后,傅新元報(bào)考了南京大學(xué)的固體物理系,不料淮安地區(qū)政府卻私自扣除了當(dāng)時(shí)公辦老師們的高考準(zhǔn)考證,為此他先是在淮安教育局長家 “大鬧一場”,接著又在1977年的最后一天坐長途汽車到南京教育局 “告狀”,正巧遇到了江蘇教育局的廳長在元旦期間值班,最終為自己爭取到了上大學(xué)的機(jī)會(huì),陰差陽錯(cuò)地被南京師范大學(xué)生物系錄取。

本科期間傅新元讀了許多英文編寫的教科書,還將其中一本介紹遺傳分析的教材進(jìn)行了翻譯,寄給了復(fù)旦大學(xué)的談家禎教授。談先生對(duì)傅新元展現(xiàn)出的才華十分賞識(shí),同時(shí)也告誡他,相比于編譯教材,在現(xiàn)有知識(shí)的邊界大膽探索、開疆拓土才是年輕人應(yīng)當(dāng)樹立的目標(biāo)。

于是,傅新元報(bào)考了談家禎教授的研究生,并被復(fù)旦大學(xué)推薦參加第一批CUSBEA項(xiàng)目的考試。談先生在1979年接待訪華科學(xué)家時(shí),曾結(jié)識(shí)了吳健雄的一位同事 Cyrus Levinthal 教授——Levinthal教授接受了系統(tǒng)的物理學(xué)訓(xùn)練,之后研究興趣轉(zhuǎn)向生物學(xué),此時(shí)正擔(dān)任哥倫比亞大學(xué)生物系的系主任。在談先生的大力推薦下,Cyrus Levinthal 教授將傅新元招至麾下。

在 Cyrus Levinthal 的實(shí)驗(yàn)室,傅新元被安排去做利用突變分析研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的課題,這種 “體力活” 讓傅新元感到自己只是被Levinthal教授雇傭的 “打工人”,他選擇了離開,來到系里的新人教授 James Manley 手下研究RNA分子的剪切機(jī)制(注7)。[24-26]

在以分子生物學(xué)技術(shù)為強(qiáng)項(xiàng)的 James Manley 實(shí)驗(yàn)室,傅新元在博士研究生階段卻鍛煉出了過硬的生物化學(xué)功底:他意識(shí)到,細(xì)胞提取物對(duì)于生化學(xué)家而言就是一座巨大的寶庫,生物化學(xué)手段可以成為攻克重大科學(xué)問題的一大利器。

對(duì)于博士后的方向,傅新元希望能在細(xì)胞水平研究外源信號(hào)如何對(duì)基因表達(dá)造成影響。在讀到 Sidney Pestka 于1987年發(fā)表的綜述文章后,傅新元對(duì)干擾素的作用機(jī)制產(chǎn)生了濃厚的興趣。很快他發(fā)現(xiàn)曾在RNA剪切領(lǐng)域大放異彩的同行 James Darnell 此時(shí)也開始探索干擾素信號(hào)通路。因此,傅新元鐵定決心,在1987年底申請(qǐng)加入了Darnell的團(tuán)隊(duì)(注8)。

此時(shí),ISGF-1、ISGF-2、ISGF-3剛剛顯露出蹤跡,傅新元的到來正是時(shí)候。

“傅,我很欣賞你的生化技巧?!?James Darnell 在傅新元面試后立刻爽快地開出了offer,并幫助他申請(qǐng)到了一筆豐厚的獎(jiǎng)學(xué)金(注9)。

圖2 1989年,傅新元在美國紐約洛克菲勒大學(xué) James Darnell 實(shí)驗(yàn)室 | 受訪者供圖


 02 
來到 James Darnell 實(shí)驗(yàn)室,傅新元的第一件事就是純化蛋白。傅新元在冷庫中日夜戰(zhàn)斗,終于從三千升干擾素處理刺激的海拉細(xì)胞中,純化和提取出近10微克的ISGF-3提取物。

圖3 傅新元純化ISGF3的歷程 | 圖源[27]


此時(shí),David Levy 已經(jīng)離開實(shí)驗(yàn)室,到隔壁的紐約大學(xué)任教,傅新元就和小兄弟 Daniel Kessler 一起在蛋白分離膠上對(duì)ISGF-3進(jìn)行分析。他們發(fā)現(xiàn)ISGF-3中實(shí)際包含了4個(gè)不同的組分,并根據(jù)分子量分別將其命名為p48、p84、p91和p113,其中后三者是在I型干擾素刺激下特異性結(jié)合上去的蛋白,最有可能是參與干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子。[27]

要想對(duì)這三個(gè)蛋白進(jìn)行測序,他們還需要收集更多的蛋白樣品。此時(shí)到了1990年,Daniel Kessler 已經(jīng)畢業(yè)前往波士頓做博士后,傅新元一個(gè)人精力有限,Darnell就安排一位新加入的博士后 Chris Schindler 幫助傅新元一起完成蛋白純化的工作。

Chris Schindler 剛剛從紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院獲得內(nèi)科醫(yī)生執(zhí)照,他一邊在康奈爾醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌科行醫(yī),一邊在 James Darnell 的實(shí)驗(yàn)室做研究。

在蛋白組學(xué)專家 Ruedi Aebersold 的技術(shù)支持下,傅新元和 Chris Schindler 對(duì)這三個(gè)蛋白進(jìn)行了克隆,發(fā)現(xiàn),p84和p91實(shí)際上是由同一個(gè)基因編碼,而p113則是另一個(gè)基因合成出的產(chǎn)物。

James Darnell 決定將兩個(gè)基因的克隆拆成兩篇論文發(fā)表,傅新元和 Chris Schindler 各自收獲一篇論文的第一作者頭銜。[28,29]

憑借對(duì)ISGF-3克隆的成果,傅新元在1991年底在西奈山醫(yī)學(xué)院獲得了助理教授的職位。

 03 
但克隆出的這兩個(gè)基因究竟是如何介導(dǎo)干擾素的信號(hào)通路呢?

換句話說,基因的序列雖然知道了,但功能方面的作用機(jī)制還是一團(tuán)迷霧。傅新元帶著這個(gè)問題來到了西奈山醫(yī)學(xué)院。

隨后p84/p91和p113中SH2結(jié)構(gòu)域的發(fā)現(xiàn),促使他提出了一個(gè)大膽的猜想:“干擾素激活受體后,受體首先會(huì)發(fā)生磷酸化,接著由于SH2結(jié)構(gòu)域會(huì)與磷酸化受體結(jié)合的性質(zhì),p84/p91和p113被吸引到干擾素受體附近,進(jìn)而在受體上的某個(gè)激酶的催化下發(fā)生磷酸化修飾,由細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核,作為轉(zhuǎn)錄因子激活下游基因的表達(dá)?!?/span>

巧的是,就在他將這一猜想模型告訴 James Darnell 時(shí),恰好發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑能夠破壞ISGF-3對(duì)干擾素刺激的響應(yīng)能力,實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持傅新元的猜想。

但對(duì)于模型中 “SH2結(jié)構(gòu)域是引發(fā)ISGF-3發(fā)生磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核的關(guān)鍵” 的觀點(diǎn),Darnell和Schindler當(dāng)時(shí)都不太認(rèn)同——基于當(dāng)時(shí)的主流研究觀點(diǎn),SH2結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是蛋白激酶特有的組成,一個(gè)具有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白怎么會(huì)是轉(zhuǎn)錄因子呢?

因此Darnell婉拒了傅新元聯(lián)合署名的邀請(qǐng),決定與Schindler一起將磷酸化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果投稿到《科學(xué)》雜志。

1992年的夏天,傅新元和Darnell的論文分別在《細(xì)胞》和《科學(xué)》發(fā)表,都提出磷酸化是ISGF-3在干擾素刺激下被激活的關(guān)鍵機(jī)制,所不同的是,傅新元基于序列比對(duì)的信息,額外提出了p84/p91和p113這兩個(gè)ISGF-3組分中所包含的SH2結(jié)構(gòu)域才是介導(dǎo)信號(hào)激活的關(guān)鍵。[30,31]

然而遺憾的是,雖然他們的論文都明確指出存在一個(gè)酪氨酸激酶(當(dāng)時(shí)也稱為just another kinase) ,但是沒能確定對(duì)ISGF-3進(jìn)行磷酸化的關(guān)鍵激酶。

而對(duì)于干擾素信號(hào)通路中這個(gè)發(fā)揮承上啟下作用的關(guān)鍵激酶的鑒定,恰好就與傅新元的論文發(fā)表在了同一期的《細(xì)胞》雜志中。

圖4 傅新元在1992年提出的ISGF-3轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型 | 圖源[30]


 04 
曾幾何時(shí),George Stark 與 James Darnell 都觀察到了與ISRE序列結(jié)合的蛋白復(fù)合物。

James Darnell 招到了精通生化的傅新元,得以憑借洪荒之力克隆出ISGF-3的各個(gè)成分。

面對(duì)相似的挑戰(zhàn),George Stark 卻選擇了另一條途徑——遺傳學(xué)手段。

Stark實(shí)驗(yàn)室的博士后 Sandra Pellegrini 設(shè)計(jì)出一個(gè)精巧的遺傳學(xué)篩選方法:她將6-16的啟動(dòng)子序列與一個(gè)編碼GPT酶的基因融合在一起,導(dǎo)入HT1080細(xì)胞,然后通過DNA誘變劑ICR191隨機(jī)地引入移碼突變。隨后將干擾素處理過的細(xì)胞培養(yǎng)于存在化學(xué)物質(zhì)6-TG的培養(yǎng)基中。GPT酶可以將無毒的6-TG轉(zhuǎn)變?yōu)閯《镜?-thiol-GMP——因此大多數(shù)干擾素信號(hào)通路正常的細(xì)胞都會(huì)由于誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的GPT酶而中毒死亡,而干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被誘變劑破壞的細(xì)胞則有更大的機(jī)會(huì)在篩選中存活下來。通過這一方法,Sandra Pellegrini 獲得了一系列的 “干擾素通路缺陷” 的突變細(xì)胞株。[32]

1991年,Sandra Pellegrini 在法國巴斯德研究所得到助理教授職位。她對(duì)博士后期間篩選獲得的一部分突變細(xì)胞株進(jìn)行分子克隆。結(jié)果,她從11,1號(hào)突變體中克隆出了一個(gè)名為Tyk2的激酶,發(fā)現(xiàn)其屬于澳大利亞科學(xué)家 Andrew Wilks 不久前剛剛克隆出的一類簡稱 “JAK” 激酶家族。[33-35]

真相很快大白,JAK家族的激酶正是傅新元和 James Darnell 論文中提出對(duì)ISGF-3進(jìn)行磷酸化修飾的 “未知激酶”,而ISGF-3也正是憑借SH2結(jié)構(gòu)域才會(huì)在干擾素信號(hào)的刺激下富集到干擾素受體附近。后來,p84/p91和p113被重新命名為STAT1和STAT2。[36]

不久之后,包括 James Darnell 實(shí)驗(yàn)室在內(nèi),研究者們或通過同源序列的索引,或在利用白細(xì)胞介素-6、乳汁分泌等其他體系,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了更多STAT家族的成員??梢钥隙ǖ氖?,這些成員無一例外地都是在信號(hào)刺激下發(fā)生磷酸化修飾,進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。[37-39]

至此,干擾素作用的機(jī)制終于找到了——這條被命名為JAK-STAT的信號(hào)通路,負(fù)責(zé)將信息從細(xì)胞膜上的干擾素受體準(zhǔn)確迅捷地傳遞到細(xì)胞核內(nèi)。

細(xì)胞通路的研究歷史上,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活之間第一次被直接建立起了聯(lián)系,并很快就被發(fā)現(xiàn)是在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中都普遍存在的機(jī)制。

人們也立刻意識(shí)到,JAK-STAT通路在免疫系統(tǒng)在內(nèi)的眾多生理過程的調(diào)控中,都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

一個(gè)全新的領(lǐng)域誕生了。

后來的故事,我們都知道了,靶向JAK-STAT通路的藥物在癌癥、風(fēng)濕、甚至是COVID-19的治療中都具有良好的表現(xiàn)。[40-44]

值得一提的是,傅新元先后兩次請(qǐng) James Darnell 幫忙修改自己作為唯一作者投稿到《細(xì)胞》的論文。不過,他論文中并沒有涉及將p84/p91和p113的SH2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行刪除的實(shí)驗(yàn),沒有論證SH2結(jié)構(gòu)域?qū)τ贗SGF3響應(yīng)干擾素刺激的必要性。這可能是 James Darnell 和 Chris Schindler 當(dāng)時(shí)不相信傅新元模型的原因。

1992年5月,James Darnell 在康奈爾醫(yī)學(xué)院作學(xué)術(shù)報(bào)告,曾有研究者圍繞SH2結(jié)構(gòu)域提問,當(dāng)時(shí) James Darnell 否認(rèn)了SH2結(jié)構(gòu)域的重要性。Salk研究所的 Tony Hunter 是傅新元論文的審稿人。6月,Hunter告訴到訪的Darnell,“傅是對(duì)的!”。Darnell當(dāng)時(shí) “幾乎從椅子上差點(diǎn)摔落下來”,他驚訝極了。原來,傅新元告訴他的SH2結(jié)構(gòu)域,讓他忽略的有點(diǎn)可惜。幸虧傅新元的堅(jiān)持,干擾素信號(hào)通路中關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域才得以被廣泛認(rèn)可。如今,在成千篇關(guān)于STAT的研究論文中,誰又能躲得過他發(fā)現(xiàn)的SH2結(jié)構(gòu)域呢!


圖5 Chris Schindler和James Darnell在1992年提出的ISGF-3轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型 | 圖源[31]


 - 致 謝 -

感謝傅新元教授在百忙之中接受《知識(shí)分子》的采訪,感謝常智杰教授對(duì)本文提出的寶貴建議。

 注釋:下滑動(dòng)可瀏覽)

注1:事實(shí)上,在Alick Isaacs和Jean Lindenmann之前,東京大學(xué)傳染病研究所的Yasu-ichi Nagano和Yasuhiko Kojima已經(jīng)在被流感病毒感染的細(xì)胞會(huì)分泌出某種抗病毒的因子,于1954年發(fā)表。45

注2:在被克隆之前,干擾素的物種特異性為批量生產(chǎn)在技術(shù)上帶來了很大挑戰(zhàn):即小鼠細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素在人體內(nèi)缺乏抗病毒活性。

注3:I型干擾素包含IFN-α和IFN-β。準(zhǔn)確地說,Darnell實(shí)驗(yàn)室的IFN-β主要來自杜邦公司,而IFN-α則是來自羅氏公司波蘭裔生化學(xué)家Sidney Pestka的饋贈(zèng)。

注4:Bob Schreiber一度相信干擾素受體的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化是激活下游通路的關(guān)鍵,但傅新元基于ISGF-3的數(shù)據(jù)告訴他酪氨酸更可能是重要的修飾位點(diǎn),由此幫助Bob Schreiber避免出發(fā)表一篇結(jié)論錯(cuò)誤的論文。

注5:海拉細(xì)胞受到干擾素刺激后大量合成的兩個(gè)基因,其蛋白產(chǎn)物分子量分別為54kDa和15kDa。ISG-15由Pete Knight團(tuán)隊(duì)克隆,Darnell實(shí)驗(yàn)室博后Nancy Reich對(duì)其介導(dǎo)干擾素引發(fā)的激活反應(yīng)進(jìn)行了充分性方面的功能驗(yàn)證。46,47

注6:ISGF-2和ISGF-3的區(qū)別在于干擾素處理下結(jié)合ISG-54速度的差異。在當(dāng)時(shí)很難判斷哪個(gè)復(fù)合物中找到的蛋白更重要。ISGF-3更有希望的一個(gè)原因是其較快的反應(yīng)速度與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄變化對(duì)于干擾素的響應(yīng)速度更貼合。James Darnell的博后Richard Pine解析、克隆了ISGF-2的組分,但很遺憾最終沒有找到像JAK-STAT通路那樣影響深遠(yuǎn)的分子。48

注7:傅新元在博士臨近畢業(yè)之際,偶然發(fā)現(xiàn)了HEK293與HeLa這兩種不同的細(xì)胞的提取物具有不同的剪切活性,據(jù)此推斷HEK293中富含一種獨(dú)特的剪切因子。基于傅新元建立的這一系統(tǒng),他的師弟葛輝最終鑒定出了剪切因子ASF。值得一提的是,哈佛大學(xué)Tom Maniatis實(shí)驗(yàn)室的博后付向東也在同一時(shí)期獨(dú)立鑒定出了另一個(gè)關(guān)鍵的剪切因子SC35。從發(fā)表時(shí)間上看,ASF在前,SC35在后。49,50

注8:在Darnell的支持下,傅新元獲得了一筆一年42000美元的CSI fellowship。


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制版編輯 | 姜絲鴨


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科學(xué)新媒體"知識(shí)分子"撰稿人、密歇根大學(xué)分子生物學(xué)在讀博士研究生
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