開荒者許悅：好運(yùn)在第366次降臨 | 科研外史
進(jìn)入前人沒(méi)有踏足過(guò)的荒地，對(duì)于膽小者而言是前途未卜避猶不及的窮山惡水，但對(duì)于真正的勇者，卻是大展身手封狼居胥的良田沃土。
北京生命科學(xué)研究所邵峰博士實(shí)驗(yàn)室的許悅博士，在六年半曲折的博士生涯中，在幾次實(shí)驗(yàn)遇到瓶頸之時(shí)都沒(méi)有輕言放棄，最終攻克了天然免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)異源自噬的重要問(wèn)題。本文講述了許悅博士自2013年到2019年間的研究歷程，與讀者分享她在科研道路上的探索故事。
撰文 | 黃宇翔
編輯 | 金莊維
尋寶（2013.3-2014.4）
366-C7突變體的發(fā)現(xiàn)，是整個(gè)故事的開始。 許悅博士
當(dāng)許悅在2013年3月定導(dǎo)于北京生命科學(xué)研究所邵峰博士實(shí)驗(yàn)室時(shí)，沒(méi)有什么人能想到這個(gè)外表文靜低調(diào)的北京姑娘有一天能攻克天然免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)異源自噬的重要問(wèn)題。
“安靜專注而堅(jiān)韌的小女孩，有時(shí)讓你感覺不到她的存在。”這是她在高中生物學(xué)老師張慧心目中留下的印象。也許正是這種品質(zhì)，幫助她在六年半曲折的博士生涯中，在幾次實(shí)驗(yàn)遇到瓶頸之時(shí)都不輕言放棄，最終守得云開見月明。
彼時(shí)在天然免疫學(xué)領(lǐng)域，異源自噬（Xenophagy）正是一個(gè)火熱的話題。長(zhǎng)久以來(lái)，人們一直認(rèn)為健康的“守衛(wèi)部隊(duì)”——免疫系統(tǒng)——專職負(fù)責(zé)保護(hù)機(jī)體抵抗病原菌的侵襲。但在2004年，兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：一些原本被認(rèn)為手無(wú)縛雞之力的正常組織細(xì)胞，在面對(duì)兇惡的入侵病原菌面前，并不會(huì)坐以待斃，而是會(huì)成立“敵后武裝”，在細(xì)胞內(nèi)將入侵者包圍住，送往細(xì)胞內(nèi)的“垃圾回收站”溶酶體中進(jìn)行清除處理。研究者將這種宿主細(xì)胞通過(guò)將入侵病原菌包圍并清除的過(guò)程稱作異源自噬。
到了2012年前后，《自然》、《科學(xué)》等頂級(jí)期刊上連續(xù)發(fā)表幾篇論文，找到了一些可能參與宿主細(xì)胞在實(shí)現(xiàn)對(duì)入侵病原菌進(jìn)行“垃圾的分類回收”過(guò)程調(diào)控的分子，提出宿主細(xì)胞能在病原菌蛋白上插上一種叫做“泛素”的標(biāo)簽，將其標(biāo)志為“有害垃圾”，進(jìn)而送往垃圾處理場(chǎng)進(jìn)行銷毀[1-3]。
北京生命科學(xué)研究所的邵峰團(tuán)隊(duì)，長(zhǎng)期關(guān)注病原菌的致病機(jī)制與宿主細(xì)胞的免疫抵抗，所以他們自然不會(huì)放過(guò)這條宿主細(xì)胞的抵抗通路。
經(jīng)過(guò)仔細(xì)地閱讀異源自噬方面的文獻(xiàn)報(bào)道，邵峰實(shí)驗(yàn)室的師生們敏銳地關(guān)注到當(dāng)時(shí)幾篇熱門研究存在漏洞：
首先，盡管在研究者普遍認(rèn)為泛素化修飾是觸發(fā)異源自噬的關(guān)鍵步驟，但當(dāng)時(shí)還沒(méi)有任何團(tuán)隊(duì)報(bào)道鑒定出介導(dǎo)此過(guò)程的泛素底物或泛素連接酶；
其次，當(dāng)時(shí)研究異源自噬的實(shí)驗(yàn)體系存在缺陷：細(xì)胞只會(huì)對(duì)不足20%的入侵細(xì)菌產(chǎn)生自噬響應(yīng)。由于好的體系對(duì)闡釋清楚具體的機(jī)制至關(guān)重要，因此在自噬響應(yīng)率如此低的體系下作出的結(jié)論有多扎實(shí)可靠，是需要被質(zhì)疑的。
2013年的春天，負(fù)責(zé)指導(dǎo)新生許悅做實(shí)驗(yàn)的博后師兄陸秋鶴在探索異源自噬機(jī)制過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)現(xiàn)象，而這個(gè)觀察可能是許悅此后一系列研究發(fā)現(xiàn)的源頭。
細(xì)胞有一套垃圾回收的機(jī)制，比如當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的“發(fā)電站”線粒體使用壽命達(dá)到淘汰標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，細(xì)胞能有一套將其送到垃圾回收站，將其分解為能被細(xì)胞二次利用的能量物質(zhì)，這個(gè)細(xì)胞內(nèi)部變廢為寶的過(guò)程稱作細(xì)胞自噬（Autophagy），在2016年被授予了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。轉(zhuǎn)錄因子TFEB在細(xì)胞自噬的過(guò)程中發(fā)揮了一個(gè)傳話員的職責(zé)，它在閑暇的時(shí)候會(huì)待在細(xì)胞質(zhì)中游蕩，一旦細(xì)胞有了進(jìn)行細(xì)胞自噬的需要，它就會(huì)接到上級(jí)領(lǐng)導(dǎo)mTOR通路的命令，進(jìn)入到細(xì)胞核里，結(jié)合在一系列編碼細(xì)胞自噬效應(yīng)分子的基因上游，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活作用，“叫醒”休息中的垃圾回收站工作人員，催促他們盡快到崗。
陸秋鶴博士發(fā)現(xiàn)，在異源自噬激活時(shí)，能觀察到明顯的TFEB入核行為，說(shuō)明這個(gè)細(xì)胞內(nèi)在“垃圾回收”過(guò)程中負(fù)責(zé)傳令的轉(zhuǎn)錄因子，在集結(jié)兵力對(duì)抗入侵病原菌的過(guò)程中可能也發(fā)揮了作用。
經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，陸秋鶴發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在異源自噬情景下，很可能不是mTOR通路調(diào)節(jié)TFEB入核。于是，他繼續(xù)找尋宿主細(xì)胞中激活TFEB的機(jī)制。
一個(gè)金礦出現(xiàn)在了眼前：細(xì)菌的哪些成分觸發(fā)了宿主細(xì)胞的TFEB轉(zhuǎn)移入核呢？
換句話說(shuō)，邵峰團(tuán)隊(duì)想問(wèn)的科學(xué)問(wèn)題是，當(dāng)病原菌入侵進(jìn)入細(xì)胞后，是病原菌中的哪些成分觸發(fā)了“警報(bào)”，導(dǎo)致TFEB這個(gè)傳令官得到了訊息，繼而快馬加鞭奔入細(xì)胞核？
圖 1. 細(xì)胞中的垃圾處理機(jī)制。左圖為細(xì)胞自噬的示意圖，表示細(xì)胞如何將自身產(chǎn)生的“可回收垃圾”進(jìn)行分解，變廢為寶；右圖為異源自噬的示意圖，表示宿主細(xì)胞面對(duì)“有害垃圾”病原菌的入侵，如何奮起反擊。（圖源：Huang et al., (2014) Nature Reviews Microbiology）
但是，面對(duì)一整片待開墾的處女地，該如何下手研究呢？
“當(dāng)研究沒(méi)有什么頭緒的時(shí)候，就去做個(gè)篩選吧。”邵峰老師對(duì)博士選題還沒(méi)有方向的一年級(jí)新生許悅說(shuō)道。
在眼睛看不清周圍景物、找不到研究的明確目標(biāo)時(shí)，做一個(gè)遺傳學(xué)篩選，就像是撒出一張大網(wǎng)，有可能會(huì)打開新的局面。
邵老師建議許悅在被異源自噬領(lǐng)域普遍使用的沙門氏菌中進(jìn)行遺傳學(xué)篩選。具體來(lái)說(shuō)，就是通過(guò)一種來(lái)自于噬菌體神奇分子工具——轉(zhuǎn)座子，能隨機(jī)插入沙門氏菌基因組中，進(jìn)而極大概率破壞某個(gè)基因的功能。如果能找到這樣一株細(xì)菌突變體，侵染細(xì)胞后不再能引起“傳令官”TFEB入核，那么這株突變體就很可能是編碼能觸發(fā)TFEB入核的效應(yīng)分子的基因發(fā)生了突變。假如能鑒定出這個(gè)基因，就有希望順藤摸瓜闡釋清楚細(xì)菌觸發(fā)異源自噬警報(bào)的機(jī)制。
同時(shí)，細(xì)菌的遺傳學(xué)篩選，對(duì)于一個(gè)缺乏經(jīng)驗(yàn)的博士一年級(jí)新生而言，確實(shí)是一個(gè)不錯(cuò)的選擇：
首先，在當(dāng)時(shí)，細(xì)菌的遺傳學(xué)篩選遠(yuǎn)遠(yuǎn)簡(jiǎn)單于哺乳細(xì)胞的遺傳學(xué)篩選，這是因?yàn)椴煌陔p倍體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞不同，細(xì)菌細(xì)胞是單倍體，只需要破壞單個(gè)基因就能夠?qū)崿F(xiàn)完全的基因敲除。而且，與哺乳細(xì)胞不同，細(xì)菌編碼的基因在基因組中排列緊密，且沒(méi)有內(nèi)含子，意味著隨機(jī)的插入有更高的概率破壞基因的功能；
其次，邵峰實(shí)驗(yàn)室在細(xì)菌遺傳學(xué)篩選方面擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此新手能從師兄師姐那里得到實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)方面更多的指導(dǎo)和幫助。
基于此，許悅在邵老師的指導(dǎo)下設(shè)計(jì)了這樣的一個(gè)遺傳篩選：在人的細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)一個(gè)融合紅色熒光蛋白的TFEB，用細(xì)菌遺傳突變體庫(kù)對(duì)其進(jìn)行侵染，在高通量顯微鏡下尋找能讓傳令官TFEB沉默停留在細(xì)胞質(zhì)不入核的細(xì)菌突變體。
此外，邵老師想到一個(gè)有意思、但有可能不存在的假設(shè)，沙門氏菌引發(fā)自噬的比例這么低，會(huì)不會(huì)存在抑制異源自噬的蛋白呢？考慮到篩選TFEB的同時(shí)加入另外一個(gè)熒光標(biāo)記GFP-LC3對(duì)于整個(gè)篩選并不會(huì)增加過(guò)多的工作量，邵老師建議許悅在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)篩選TFEB與LC3兩個(gè)表型。
后來(lái)的實(shí)踐證明，他們有心栽花所種下的試圖尋找TFEB入核的細(xì)菌觸發(fā)因子的嘗試并沒(méi)能開出花朵，但是無(wú)心插柳的另一個(gè)表型篩選，卻歷經(jīng)曲折，最終結(jié)出了豐碩的果實(shí)。
篩板子，是一項(xiàng)工作量不算輕的任務(wù)。
許悅將人細(xì)胞系培養(yǎng)在96孔板——96孔板是一塊手掌大小的塑料板，其中包含了96個(gè)互相獨(dú)立的豌豆大小的小孔，將好像是為細(xì)胞提供了96間獨(dú)立的公寓一樣。
同時(shí)，她還需要將一個(gè)個(gè)獨(dú)立的沙門氏菌突變體接種于96孔板，待細(xì)菌培養(yǎng)至合適的狀態(tài)后，一一對(duì)應(yīng)地去感染細(xì)胞。沙門氏菌會(huì)快速進(jìn)入細(xì)胞，在短短兩小時(shí)內(nèi)就可以觀察相應(yīng)的表型。隨后許悅將整塊96孔板在高通量顯微鏡下進(jìn)行拍攝，監(jiān)控每一個(gè)獨(dú)立“細(xì)胞公寓”中傳令官TFEB的入核以及異源自噬通路整體激活的水平。
每一批板子，從培養(yǎng)細(xì)菌鋪細(xì)胞，到最后在顯微鏡下拍攝獲得原始數(shù)據(jù)，一整套流程下來(lái)需要兩天時(shí)間。剛開始對(duì)于許悅來(lái)說(shuō)，一次只能完成五塊板子。漸漸熟練之后，一次實(shí)驗(yàn)可以操作十塊96孔板。
加上摸索實(shí)驗(yàn)條件的時(shí)間，半年很快就過(guò)去了。許悅已經(jīng)篩完了預(yù)計(jì)的300個(gè)96孔板（每塊板中實(shí)際可以篩選58個(gè)沙門氏菌突變體），看過(guò)了將近兩萬(wàn)個(gè)細(xì)菌突變體侵染宿主細(xì)胞的表型，除了發(fā)現(xiàn)很多影響細(xì)菌侵入細(xì)胞的突變體外，其他一無(wú)所獲。沙門氏菌共編碼4672個(gè)蛋白，考慮到轉(zhuǎn)座子的插入不一定會(huì)破壞基因的功能和篩選的隨機(jī)性等因素，目前檢測(cè)的300個(gè)板子并不十分保險(xiǎn)。
“我再篩100個(gè)板子吧，如果還是篩不到，我們?cè)傧雱e的辦法。”許悅認(rèn)為好不容易建立起的篩選體系，這樣放棄有點(diǎn)可惜，于是跟邵老師建議道。
好運(yùn)終于在篩選的第366塊板子上降臨。
圖2. 幸運(yùn)的第366塊板子。許悅在沙門氏菌上開展的轉(zhuǎn)座子遺傳篩選示意圖，前365塊板子一無(wú)所獲，但上天終于在她篩到第366塊板子時(shí)眷顧了她。
2014年2月13日，剛剛過(guò)完春節(jié)。許悅已經(jīng)開始在高通量顯微鏡下拍攝新年后的第三批樣品了。
TFEB的信號(hào)如往常一樣，在細(xì)菌的侵染下紛紛入核，看來(lái)又都是陰性的結(jié)果。
但是，當(dāng)她將顯微鏡切換到綠色通道時(shí)，一個(gè)散發(fā)出一簇簇亮眼熒光信號(hào)的小孔立刻吸引了她的眼球——與綠色熒光彌散在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中的此前兩萬(wàn)多個(gè)樣品不同，在這個(gè)小孔中綠色熒光信號(hào)仿佛被磁鐵吸附了一樣，匯聚成了一簇簇光點(diǎn)。在漆黑一片的背景下，好像是夜空中一顆顆閃亮的明星，散發(fā)出迷人的光亮。
大半年陰性結(jié)果籠罩的探索黑夜，此刻終于浮現(xiàn)出了點(diǎn)點(diǎn)星光。
這個(gè)突變體出現(xiàn)在篩選的366號(hào)板編號(hào)為C7的小孔中，因此許悅將這個(gè)突變體命名為366-C7。
366-C7突變體的表型非常有趣：野生型的沙門氏菌侵染細(xì)胞時(shí)，只能比較微弱地引發(fā)細(xì)胞異源自噬通路的激活，因此GFP-LC3的熒光信號(hào)總是彌漫在細(xì)胞質(zhì)中；366-C7突變菌侵染細(xì)胞，卻會(huì)引發(fā)GFP-LC3的聚集，表明宿主細(xì)胞的異源自噬通路大幅度增強(qiáng)，說(shuō)明366-C7株系很可能是一個(gè)細(xì)菌中原本會(huì)抑制宿主細(xì)胞異源自噬通路激活的基因發(fā)生了突變。
利用分子生物學(xué)技術(shù)，許悅很快鑒定出366-C7突變體在基因組中插入的位置：一個(gè)編號(hào)為SL1344_1177的基因被破壞。1177代表這是該沙門氏菌株系的第1177個(gè)基因，對(duì)于這個(gè)基因，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中只顯示它包含了374個(gè)氨基酸。至于結(jié)構(gòu)和功能，當(dāng)時(shí)還沒(méi)有任何記載。
看來(lái)是挖到寶了。許悅心中竊喜。
進(jìn)入前人沒(méi)有踏足過(guò)的荒地，對(duì)于膽小者而言是前途未卜避猶不及的窮山惡水，但對(duì)于真正的勇者，卻是大展身手封狼居胥的良田沃土。
緊接著完成了的1177號(hào)基因的定向突變和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)一步鞏固了她的猜想：1177號(hào)基因是一個(gè)全新的沙門氏菌觸發(fā)自噬通路的抑制因子。并且它是沙門氏菌III型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白，可以直接進(jìn)入真核細(xì)胞中發(fā)揮功能。
邵老師后來(lái)決定將這個(gè)基因命名為SebX，代表沙門氏菌中抑制異源自噬的效應(yīng)分子（Salmonella effector blocking Xenophagy）。更有意思的是，SebX對(duì)其他細(xì)菌引起的自噬同樣具有抑制效果，但對(duì)于已經(jīng)研究得非常清楚的經(jīng)典自噬通路卻沒(méi)有影響。
圖3. SebX突變體的表型。與其他突變體相比，366-C7突變體（右上）中GFP-LC3呈現(xiàn)明顯聚集狀態(tài)。許悅經(jīng)過(guò)基因定位發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變體是一個(gè)以前從未被報(bào)道過(guò)的基因發(fā)生了突變，最初將它命名為SebX。
2014年的4月，許悅正式成了第一個(gè)發(fā)現(xiàn)沙門氏菌編碼抑制異源自噬蛋白的人。但還沒(méi)來(lái)得及慶祝，她很快就陷入了這片新大陸上迷霧與泥沼的重重包圍之中。
迷霧（2014.4-2015.1）
SebX抑制異源自噬的機(jī)制是什么？這是橫亙?cè)谠S悅面前的重要問(wèn)題。要想回答這個(gè)問(wèn)題，按照常規(guī)的思路一般會(huì)從兩個(gè)方面入手：
第一，大多數(shù)細(xì)菌效應(yīng)蛋白都是酶，也就是說(shuō)能催化生物體內(nèi)特定化學(xué)反應(yīng)的高效發(fā)生。因此，許悅前進(jìn)的一個(gè)方向是去探尋SebX在細(xì)胞內(nèi)所能催化的生化反應(yīng)，即嘗試去找到這個(gè)蛋白的酶學(xué)活性。
第二，假若SebX有酶活性，還可以通過(guò)尋找與它存在相互作用的蛋白組分，鑒定出它所催化的反應(yīng)的底物，進(jìn)而更好地理解它作用的機(jī)制。
但在當(dāng)時(shí)，還沒(méi)有一篇對(duì)于SebX的研究記載，看來(lái)前人從未對(duì)這個(gè)蛋白有過(guò)研究。缺乏線索的許悅此刻仿佛身處在一團(tuán)迷霧之中。
基于自噬通路中已闡明的機(jī)制以及邵峰團(tuán)隊(duì)過(guò)往研究細(xì)菌效應(yīng)分子的豐富經(jīng)驗(yàn)，許悅提出了關(guān)于SebX可能作用機(jī)制的七種假設(shè)，仿佛是制作了七條錦囊妙計(jì)，并逐一設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。
七個(gè)錦囊逐一被許悅拆開了——她用嚴(yán)謹(jǐn)扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將自己此前所作出的假設(shè)一一推翻。
“看來(lái)我們已經(jīng)積攢了七個(gè)Supplementary的數(shù)據(jù)。”邵老師在與許悅討論陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)開著玩笑說(shuō)道。
大半年的時(shí)光在拆錦囊的過(guò)程中無(wú)聲無(wú)息地流走了，許悅的課題在迷霧中兜了七個(gè)圈子，最終還是回到了原地。
?
聯(lián)手（2015.1-2016.4）
我必須承認(rèn)，幸運(yùn)喜歡照顧勇敢的人。 查爾斯·達(dá)爾文（1809-1882）
周平博士是在2015年年初的時(shí)候參與到許悅的課題研究中的。周平在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉榜教授實(shí)驗(yàn)室獲得博士學(xué)位，博士期間用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對(duì)豬呼吸道病毒感染肺部巨噬細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行研究。懷著對(duì)天然免疫系統(tǒng)的強(qiáng)烈興趣，他在2012年作為博后加入了邵峰實(shí)驗(yàn)室。
可是，四周霧氣這么重，他們?cè)趺床拍艽蜷_研究的突破口呢？
“當(dāng)研究沒(méi)有什么頭緒的時(shí)候，就去做個(gè)篩選吧。”邵峰老師云。
希望再一次寄托在遺傳學(xué)篩選這張看上去無(wú)所不能的神奇大網(wǎng)上。
但是，與對(duì)細(xì)菌進(jìn)行遺傳篩選不同，對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行遺傳篩選更加困難。真核細(xì)胞是二倍體，而且基因組中真正編碼蛋白質(zhì)的比例僅占全基因組序列的1%左右。在21世紀(jì)的第一個(gè)十年里，基于RNA干擾技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞作遺傳學(xué)篩選是當(dāng)時(shí)技術(shù)限制下最好的方法，但依然困難重重。
但就在許悅博士一年級(jí)期間，生物學(xué)領(lǐng)域所發(fā)生的一項(xiàng)歷史性突破，大大降低了哺乳細(xì)胞遺傳篩選的難度。
2013年初，麻省理工學(xué)院的張鋒團(tuán)隊(duì)報(bào)道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對(duì)真核細(xì)胞的基因組進(jìn)行高效編輯，并且很快設(shè)計(jì)出幾乎覆蓋全基因組的gRNA文庫(kù)。周平博士的工作內(nèi)容之一便是在這一技術(shù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9遺傳篩選體系，尋找參與異源自噬的關(guān)鍵基因[4, 5]。
可是由于課題的特殊性質(zhì)，建立回答這個(gè)特定問(wèn)題的CRISPR遺傳篩選系統(tǒng)的道路注定充滿荊棘：利用CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行遺傳篩選的原理，是希望能通過(guò)某一表型將感興趣基因被敲除的細(xì)胞與其他基因敲除的細(xì)胞分開，再通過(guò)對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序通過(guò)gRNA的富集將感興趣的基因找出來(lái)。這個(gè)表型需要足夠強(qiáng)，比如細(xì)胞的死活是CRISPR篩選系統(tǒng)被最常使用的判斷表型——假如研究者想研究癌細(xì)胞對(duì)化療藥產(chǎn)生抵抗的機(jī)制，就可以用藥物去殺傷癌細(xì)胞，沒(méi)被殺死的癌細(xì)胞很可能就是在化療藥作用的通路上的基因被敲除，進(jìn)而可以免疫藥物的殺傷。
那么該如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，才能將發(fā)生異源自噬和不發(fā)生異源自噬的宿主細(xì)胞區(qū)分開呢？
GFP-LC3的熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的分布變化可以是反映異源自噬水平的標(biāo)志：許悅當(dāng)初發(fā)現(xiàn)366-C7，就是觀察到異源自噬水平強(qiáng)的細(xì)胞中GFP-LC3聚成了一簇簇明亮的小團(tuán)，而異源自噬水平低的細(xì)胞中GFP-LC3是彌散在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中的。
但存在一個(gè)很大的問(wèn)題：GFP-LC3熒光信號(hào)在亞細(xì)胞水平分布上的差異可以在顯微鏡下通過(guò)人眼分辨，但一次遺傳學(xué)篩選要考察上億個(gè)細(xì)胞的GFP-LC3熒光信號(hào)分布差異，僅憑周平和許悅兩雙眼睛來(lái)看，恐怕花上幾十年也看不完。
流式細(xì)胞儀可以基于細(xì)胞熒光強(qiáng)度的不同，以每秒鐘上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的速度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，看上去是一個(gè)不錯(cuò)的解放人力的方案。
但是問(wèn)題來(lái)了：一般流式細(xì)胞儀只能測(cè)量出每個(gè)細(xì)胞整體的熒光強(qiáng)度，但對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)，異源自噬水平高低差異，僅僅體現(xiàn)在綠色熒光信號(hào)的分布上，在整個(gè)細(xì)胞水平，熒光信號(hào)強(qiáng)度并沒(méi)有出差異。也就是說(shuō)：低通量人眼能辨別的差異，高通量的儀器覺察不出來(lái)。
遇到如此大的困難，不如就此放棄了吧？
這個(gè)時(shí)候，周平博士對(duì)問(wèn)題進(jìn)行了仔細(xì)的思考：他想，流式細(xì)胞儀區(qū)分不出細(xì)菌自噬水平不同細(xì)胞的本質(zhì)，是一個(gè)關(guān)于信噪比的問(wèn)題。對(duì)于細(xì)菌自噬水平高的細(xì)胞而言，有效的信號(hào)其實(shí)是在膜泡上聚集成團(tuán)的GFP-LC3，散布在細(xì)胞質(zhì)中的GFP-LC3是干擾檢測(cè)的背景噪音；在細(xì)菌自噬水平低的細(xì)胞中，彌散在細(xì)胞質(zhì)中的“噪音”實(shí)在是太強(qiáng)了，以至于鳩占鵲巢，掩蓋了希望檢測(cè)的信號(hào)。因此，要想幫助儀器辨別出兩類細(xì)胞的差異，關(guān)鍵需要在提高信噪比方面下功夫。
提高信噪比，一種思路是提升信號(hào)本身強(qiáng)度，另一種是降低背景信號(hào)。為了實(shí)現(xiàn)第一點(diǎn)，周平博士首先在細(xì)菌中表達(dá)了一類黏附分子AFA，使得細(xì)菌能通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞表面分子CD55，粘在細(xì)胞表面，從而使得更高比例的細(xì)菌能進(jìn)入細(xì)胞感染，更多的細(xì)胞的細(xì)菌自噬通路被激活，從而觀察到更多的細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)團(tuán)的綠色熒光信號(hào)。
如何才能降低細(xì)胞質(zhì)中熒光信號(hào)背景呢？周平從物理化學(xué)的角度進(jìn)行思考：聚團(tuán)的GFP-LC3和彌散的GFP-LC3不同之處在于，前者經(jīng)過(guò)脂質(zhì)修飾，附著在膜上，而后者水溶性較強(qiáng)。基于這一本質(zhì)上的差別，周平博士萌生了一個(gè)精巧的想法：假若能用一種試劑，在細(xì)胞膜上打一些小孔，讓水溶性的GFP-LC3流出，細(xì)胞中只留存脂溶性的聚團(tuán)的GFP-LC3，如此處理過(guò)后的兩類細(xì)胞熒光信號(hào)強(qiáng)度的差異，不就能被流式細(xì)胞儀識(shí)別了嗎？
基于2010年瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院McInerney實(shí)驗(yàn)室的一篇報(bào)道，周平博士用一種比較弱的去垢劑——皂苷（saponin）——處理細(xì)胞，驚喜地發(fā)現(xiàn)這種方法能將背景降到足夠流式細(xì)胞儀分辨兩組細(xì)胞的程度[6]。如此處理過(guò)后，似乎就能通過(guò)流式細(xì)胞儀將感興趣的少數(shù)異源自噬通路被抑制的細(xì)胞從大量異源通路正常被激活的細(xì)胞中分選出來(lái)，進(jìn)而通過(guò)研究這些細(xì)胞中g(shù)RNA的富集程度，推斷細(xì)胞中哪些基因的破壞會(huì)導(dǎo)致異源自噬通路的抑制。
找到了看上去如此理想的條件，周平迫不及待地展開了第一輪篩選。
然而經(jīng)歷了忙碌的兩個(gè)月，當(dāng)看到測(cè)序分析的結(jié)果后，周平和許悅都有點(diǎn)失望：按照他們?cè)鹊脑O(shè)想，在異源自噬通路被抑制的細(xì)胞中，應(yīng)該能檢測(cè)到那些此前已知的參與到異源自噬過(guò)程的基因，現(xiàn)實(shí)卻是，他們并沒(méi)有觀察到這些陽(yáng)性對(duì)照gRNA的富集。
本來(lái)冀望通過(guò)撒網(wǎng)的方式希望能尋找突破口，可忙活了半天拿到結(jié)果之后才發(fā)現(xiàn)，自己在用的原來(lái)是一張破網(wǎng)。
換句話說(shuō)，就是實(shí)驗(yàn)的結(jié)果非常糟糕，遺傳篩選的體系還需要進(jìn)一步優(yōu)化，這次篩選得到的候選基因沒(méi)有任何科學(xué)意義。
為什么篩選會(huì)失敗？周平很快從失落中調(diào)整過(guò)來(lái)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行冷靜的思考。他發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前的方法主要存在兩個(gè)很大的問(wèn)題：第一，GFP-LC3信號(hào)的強(qiáng)度是連續(xù)的，因此在流式細(xì)胞儀上如何劃分選擇的界限，是一個(gè)容易因?yàn)橹饔^因素引入偏差的步驟；其次，使用表達(dá)AFA的菌株進(jìn)行侵染，固然提升了侵染效率，但同時(shí)由于在GFPlow細(xì)胞亞群中依然存在大量未發(fā)生異源自噬的假陽(yáng)性細(xì)胞，嚴(yán)重影響了篩選的質(zhì)量。
在把網(wǎng)再次撒出以前，得把這張網(wǎng)上的漏洞一一補(bǔ)牢才行。補(bǔ)網(wǎng)的第一步，是希望能找到一個(gè)客觀的劃分綠色熒光閾值的標(biāo)準(zhǔn)。周平博士絞盡腦汁，想到了一個(gè)絕好的參照系，即將攜帶了另一種紅色熒光蛋白不經(jīng)歷gRNA文庫(kù)敲除、同時(shí)異源自噬下游一個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)基因ATG5敲除的對(duì)照細(xì)胞從細(xì)菌侵染的步驟開始就與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞混在一起處理，作為劃界的標(biāo)準(zhǔn)。
接下來(lái)挑戰(zhàn)第二個(gè)漏洞——如何才能降低假陽(yáng)性細(xì)胞的干擾呢？經(jīng)過(guò)冷靜的分析，周平發(fā)現(xiàn)，問(wèn)題的關(guān)鍵出在那些表面黏附有細(xì)菌、但實(shí)際又沒(méi)有被細(xì)菌感染的那些細(xì)胞，只要在實(shí)驗(yàn)中將這部分細(xì)胞清除掉，就可以很好地降低假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。
訓(xùn)練有素的生物學(xué)家在解決技術(shù)問(wèn)題時(shí)，會(huì)去思考實(shí)驗(yàn)背后的生物化學(xué)原理。
周平心想，細(xì)菌粘附在細(xì)胞表面，本質(zhì)上是細(xì)菌的AFA蛋白與細(xì)胞膜上的CD55之間的非共價(jià)相互作用。假若能在細(xì)菌侵染之后、細(xì)胞分選之前增加一步特殊處理，破壞AFA與CD55之間的作用，洗脫細(xì)胞表面粘附的細(xì)菌，是不是就可以通過(guò)細(xì)胞中細(xì)菌熒光蛋白的信號(hào)作為分界線消除這部分來(lái)自假陽(yáng)性細(xì)胞的干擾呢？
于是，周平嘗試了一系列能使蛋白質(zhì)變性的物質(zhì)，最終發(fā)現(xiàn)，乙醇處理能顯著降低假陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
2016年4月1日，經(jīng)歷了一年多反復(fù)的試錯(cuò)，周平博士打開了第五輪優(yōu)化篩選的測(cè)序分析結(jié)果——篩選質(zhì)量極高，異源自噬通路已知的陽(yáng)性對(duì)照基因紛紛從兩萬(wàn)多個(gè)基因中被拎出了隊(duì)伍。篩選總共發(fā)現(xiàn)了87個(gè)候選基因可能與異源自噬通路相關(guān)。
他們欣喜地感受到，身邊足足糾纏了兩年的濃霧終于稍有消散，露出了一些可以繼續(xù)前進(jìn)的道路。
圖4. 艱難的CRISPR遺傳篩選。為了找到宿主細(xì)胞中參與異源自噬的基因，周平博士開展了一個(gè)全基因組的遺傳學(xué)篩選。由于所要回答科學(xué)問(wèn)題的特殊性，這個(gè)遺傳篩選體系的建立經(jīng)歷了很多波折。
花明（2016.4-2016.12）
許悅和周平在得到遺傳篩選結(jié)果后做的第一件事，就是驗(yàn)證篩選的結(jié)果，他們針對(duì)每一個(gè)候選基因單獨(dú)設(shè)計(jì)了多條gRNA，同時(shí)與Cas9蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞，快速檢驗(yàn)敲除該基因是否能重現(xiàn)篩選的表型，即是否會(huì)下調(diào)異源自噬水平。測(cè)驗(yàn)的結(jié)果是，大多數(shù)的小道都是死胡同，單獨(dú)敲除該基因沒(méi)有表型。
除了已知陽(yáng)性對(duì)照基因以外，只剩下五個(gè)基因結(jié)果可被重復(fù)：ATP6AP1, ATP6AP2, ATP6V1F, ATP6V0C, ATP6V1H。
這五個(gè)基因其實(shí)都是編碼是細(xì)胞中同一個(gè)復(fù)合物的組成亞基，而這個(gè)復(fù)合物則是一個(gè)在生物化學(xué)領(lǐng)域名氣非常大的蛋白——V-ATPase。
V-ATPase是一個(gè)蛋白復(fù)合物，就像是一臺(tái)離子泵，通過(guò)水解ATP分子獲得轉(zhuǎn)動(dòng)的能量，將氫離子從氫離子濃度低的細(xì)胞質(zhì)泵到濃度較高的膜泡中。
但對(duì)于V-ATPase復(fù)合物可能參與異源自噬過(guò)程的這個(gè)發(fā)現(xiàn)，許悅卻感到喜憂參半。
喜的是，可靠的遺傳篩選結(jié)果加上一連串跟進(jìn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，她對(duì)于V-ATPase在異源自噬事件中的必要性成竹在胸，這一點(diǎn)此前從未有人報(bào)道過(guò)；憂的是，V-ATPase是一個(gè)對(duì)細(xì)胞生存至關(guān)重要的膜蛋白復(fù)合物，研究起來(lái)技術(shù)上存在很大的挑戰(zhàn)。此外，在機(jī)制上如何能將V-ATPase從其眾多功能中區(qū)分出來(lái)，與異源自噬聯(lián)系在一起，她還沒(méi)有一點(diǎn)頭緒。
茨威格在《人類群星閃耀時(shí)》中曾寫道，在某一個(gè)特定瞬間，一個(gè)人會(huì)被歷史的進(jìn)程推到一個(gè)特別的地方，在那里見到前人不曾見過(guò)的壯麗景色。茨威格寫這句話的背景，是在形容橫穿美洲大陸看到一望無(wú)際的太平洋時(shí)刻的探險(xiǎn)家巴爾博亞，以及一夜天才寫出不朽杰作《馬賽曲》的魯日。
但在科學(xué)探索的道路上，經(jīng)過(guò)艱苦跋涉、沖破重重險(xiǎn)阻之后，忽然的靈光一現(xiàn)，將過(guò)往的數(shù)據(jù)整合在一起、將邏輯鏈條串聯(lián)通順的剎那，大腦中仿佛一道閃電劃過(guò)漆黑的夜空，一切都變得豁然開朗，研究者從中收獲的快樂(lè)和滿足可能不遜于茨威格筆下那些英雄們。
2016年5月的一天，許悅在分析一份新鮮出爐的質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí)，就經(jīng)歷了類似于兩千多年以前一位古希臘先哲高呼“Eureka”的高光時(shí)刻。
早在2015年年初周平開始摸索CRISPR遺傳篩選條件的同時(shí)，許悅沒(méi)有停下探索的腳步?；诋?dāng)時(shí)已有的線索，她在人細(xì)胞系上構(gòu)建出多個(gè)和自噬相關(guān)的基因敲除細(xì)胞系，并嘗試借此探究哪些基因可能參與到異源自噬的過(guò)程。在自噬通路中的ATG16L1基因敲除與截短體回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，她發(fā)現(xiàn)ATG16L1的WD40結(jié)構(gòu)域參與異源自噬過(guò)程，但對(duì)于經(jīng)典自噬通路不重要。不過(guò)這個(gè)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有讓課題有突破性進(jìn)展，因?yàn)榻?jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有結(jié)果將SebX與ATG16L1聯(lián)系在一起。
在確認(rèn)V-ATPase參與到異源自噬之后，許悅試圖通過(guò)在V-ATPase結(jié)合的蛋白中尋找一點(diǎn)繼續(xù)做下去的草蛇灰線。她嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卦O(shè)計(jì)了平行對(duì)照與實(shí)驗(yàn)組，選取其中一個(gè)亞基進(jìn)行免疫共沉淀。當(dāng)拿到質(zhì)譜結(jié)果時(shí)，許悅掃了一下清單，豐度最高的蛋白都是V-ATPase復(fù)合物中的成分，這都在預(yù)料之中。但隨著清單的下拉，她的視線突然定格在了 “ATG16L1”，想不到這個(gè)熟悉的蛋白竟會(huì)在細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)。在確認(rèn)ATG16L1在陰性對(duì)照組渺無(wú)蹤跡之后，一陣狂喜涌上心頭——是了，眾里尋他千百度，聯(lián)系V-ATPase與異源自噬之間的關(guān)鍵蛋白原來(lái)就是ATG16L1！邏輯鏈條上關(guān)鍵的一環(huán)終于被扣上了。
圖5. 激動(dòng)人心的Eureka時(shí)刻。當(dāng)許悅看到這一質(zhì)譜結(jié)果時(shí)，立刻想通了V-ATPase與自噬通路的聯(lián)系。ATG16L1僅在病原體自噬通路激活的細(xì)胞中可以被V-ATPase富集檢測(cè)到，說(shuō)明V-ATPase很可能是通過(guò)ATG16L1觸發(fā)了病原體自噬通路。
接下來(lái)的兩個(gè)月里，許悅一鼓作氣，最終論證出ATG16L1利用WD40結(jié)構(gòu)域與V-ATPase復(fù)合物發(fā)生直接相互作用。
還記得在剛剛找到SebX時(shí)許悅曾試圖尋找它的酶活性質(zhì)但始終毫無(wú)進(jìn)展嗎？
這條道路的探索此時(shí)也出現(xiàn)了一點(diǎn)新的眉目。
在許悅和周平在忙乎著優(yōu)化CRISPR遺傳篩選的同時(shí)，與邵峰實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期合作的中科院生物物理所的副研究員丁璟珒博士主動(dòng)請(qǐng)纓，試圖解析SebX的結(jié)構(gòu)。一個(gè)神來(lái)之筆的截短改變，幫助丁璟珒博士成功獲得了SebX的晶體，并在2016年的年底解出了SebX晶體結(jié)構(gòu)。SebX的結(jié)構(gòu)提示它可能是一個(gè)ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶。很快許悅也通過(guò)體外的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了SebX能促進(jìn)NAD+的水解，說(shuō)明SebX極有可能具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，支持基于結(jié)構(gòu)作出的推測(cè)。
到了2016年底，博士五年級(jí)的許悅幾乎收集齊了講出一個(gè)震驚整個(gè)異源自噬領(lǐng)域故事的全部資料。
此時(shí)，距離整個(gè)故事邏輯鏈條的完善，只差一塊拼圖。
2016年底的許悅斗志昂揚(yáng)，士氣高漲。那時(shí)的她絕不會(huì)想到，為了這最后一塊拼圖的嵌入，她將在接下來(lái)的將近兩年里繼續(xù)經(jīng)歷煎熬。
許悅?cè)绾握业阶詈笠粔K關(guān)鍵的拼圖？請(qǐng)看另一篇文章。
科研論文的發(fā)表，是對(duì)科研工作者辛勤努力的豐厚獎(jiǎng)賞，但其中也充滿了遺憾：當(dāng)代科研論文為了保證邏輯的通順，發(fā)表時(shí)的行文順序與研究者實(shí)際開展研究的順序往往大相徑庭——對(duì)于作者來(lái)說(shuō)，論文中一句簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單的過(guò)渡，背后可能藏著道不盡的嘔心瀝血與辛酸苦澀；而對(duì)于讀者，閱讀一篇邏輯縝密的科學(xué)論文，固然能高效地獲取相關(guān)領(lǐng)域的最新知識(shí)，但同時(shí)卻錯(cuò)過(guò)了論文背后作者在探索未知道路上摸爬滾打的歷程，實(shí)在是極大的損失。
“科研外史”系列文章希望能在論文作者和讀者之間搭建一個(gè)橋梁，讓作者有機(jī)會(huì)在這里分享科研路上看到奇?zhèn)ス妍惥吧珪r(shí)的那份歡喜，以及在實(shí)驗(yàn)陷入停滯時(shí)內(nèi)心跌入深淵谷底的絕望與掙扎；對(duì)于讀者，了解論文發(fā)表背后曲折的探索故事，一方面能從作者克服困難的經(jīng)驗(yàn)中學(xué)習(xí)，積累科學(xué)研究的方法論，在未來(lái)自己遇到類似困難時(shí)能有更出色的應(yīng)對(duì)。但更重要的是，希望借助“科研外史”系列，讀者們能夠從一篇篇優(yōu)雅精致的論文背后，看到一個(gè)個(gè)有血有肉的科學(xué)家——他們有著自己的喜怒哀樂(lè)，在課題有進(jìn)展時(shí)會(huì)感到喜悅，在遇到瓶頸時(shí)會(huì)失望郁悶。他們平凡，可能只是等車時(shí)我們身邊的一個(gè)普通路人；他們卓越，是因?yàn)樵谀骋恍┨貏e的時(shí)刻，正是他們堅(jiān)忍不拔、永不言敗的精神，開拓著全人類自然科學(xué)知識(shí)的邊疆。
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