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新一代高精度單堿基基因編輯工具問(wèn)世

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CRISPR/Cas9的衍生工具DNA單堿基編輯技術(shù)可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實(shí)現(xiàn)單核苷酸的定向突變，為單堿基突變引起的遺傳性疾病的治療帶來(lái)了希望，自2016年首次報(bào)道以來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。2019年，單堿基編輯工具的安全性受到了質(zhì)疑，先是楊輝等研究組報(bào)道了胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴(yán)重的DNA脫靶，接著Keith Joung團(tuán)隊(duì)、David Liu團(tuán)隊(duì)和楊輝團(tuán)隊(duì)又分別報(bào)道了胞嘧啶單堿基編輯器和腺嘌呤單堿基編輯器存在大量的RNA脫靶效應(yīng)。雖然先前的研究中通過(guò)引入突變的方式顯著降低了RNA的脫靶，但是胞嘧啶單堿基編輯器的DNA脫靶依然沒(méi)有得到解決。

5月18日，Nature Methods 期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects 的研究論文，該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）楊輝研究組、中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所隸屬的計(jì)算生物學(xué)研究所（中國(guó)科學(xué)院-馬普學(xué)會(huì)計(jì)算生物學(xué)研究所）李亦學(xué)研究組和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究組合作完成。該研究根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)了脫氨酶ssDNA結(jié)合的重要氨基酸，在不影響催化活性的情況下，突變相應(yīng)的氨基酸（APOBEC1上的ssDNA結(jié)構(gòu)域相應(yīng)氨基酸），從而得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體。

CBE的脫靶是由脫氨酶產(chǎn)生的。脫氨酶利用自身的ssDNA和RNA結(jié)合能力，攜帶Cas9蛋白在基因組或者轉(zhuǎn)錄組中隨機(jī)與ssDNA和RNA結(jié)合，并且利用自身催化活性將C突變?yōu)門(mén)，從而造成單堿基基因編輯工具基因組和轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)完全隨機(jī)無(wú)法預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)。對(duì)此，研究者通過(guò)兩種方式試圖降低CBE的脫靶，第一種是在CBE的脫氨酶APOBEC1上引入突變，以此消除ssDNA和RNA的結(jié)合能力。他們一共構(gòu)建了23個(gè)CBE突變體，其中4個(gè)突變體不影響基因編輯效率檢測(cè)，而后通過(guò)DNA和RNA的脫靶檢測(cè)后獲得的3個(gè)突變體BE3R126E、BE3R132E和YE1-BE3能夠顯著降低DNA和RNA的脫靶SNV。該方法是通過(guò)突變APOBEC1上的核酸結(jié)合域關(guān)鍵位點(diǎn)，改變蛋白構(gòu)象，破壞結(jié)合能力，降低隨機(jī)脫靶。另外一種方式是利用來(lái)自于人的APOBEC3A蛋白替換APOBEC1蛋白，并在APOBEC3A的ssDNA結(jié)合位點(diǎn)引入突變，但是這種方式只能降低RNA的脫靶，而不能降低DNA上的脫靶。因此，該研究以YE1-BE3為研究重點(diǎn)。為進(jìn)一步提高YE1-BE3編輯效率，研究者隨后又在突變體基礎(chǔ)上增加標(biāo)簽和核定位序列（FNLS）。優(yōu)化后的單堿基編輯工具YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下，顯著提高了基因編輯效率，從而成為既安全又高效的新型基因編輯工具。

該研究結(jié)果和David Liu團(tuán)隊(duì)今年2月10日發(fā)表在Nature Biotechnology 的研究結(jié)論一致，兩篇文章都報(bào)道YE1在保持較高的編輯效率的同時(shí)降低了DNA和RNA上的脫靶，同時(shí)縮小了編輯窗口，并降低了indel產(chǎn)生的比例。但是David Liu團(tuán)隊(duì)基于細(xì)菌抗性篩選的方法只適用于CBE，而楊輝團(tuán)隊(duì)基于GOTI的方法是不受限制的，不僅可以檢測(cè)單堿基編輯器，還可以用于其它基于融合蛋白的基因編輯工具的安全性檢測(cè)和改進(jìn)。在本研究中楊輝團(tuán)隊(duì)使用GOTI和RNA-Seq同時(shí)檢測(cè)了突變體的DNA脫靶和RNA脫靶，并且發(fā)現(xiàn)DNA和RNA的脫靶是互相獨(dú)立的，需要同時(shí)檢測(cè)。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所研究員左二偉，中科院分子細(xì)胞卓越創(chuàng)新中心博士孫怡迪，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所助理研究員袁堂龍，中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心博士賀冰冰和周昌陽(yáng)為論文共同第一作者，楊輝、李亦學(xué)和左二偉為共同通訊作者。