管軼等新證據(jù)：穿山甲為冠狀病毒的中間宿主？
被誤認(rèn)為“逃兵”的管軼教授沒(méi)有閑著，他的課題組努力尋找新冠病毒的中間宿主，也就是問(wèn)介于儲(chǔ)存宿主蝙蝠和人之間的宿主是什么？這是對(duì)于預(yù)防新冠病毒再次感染人很有意義的問(wèn)題。管軼教授實(shí)驗(yàn)室新的論文提供更多證據(jù)，從多個(gè)穿山甲發(fā)現(xiàn)多個(gè)冠狀病毒，與新冠病毒有相似性。這些發(fā)現(xiàn)提示穿山甲很可能是中間宿主。有些科學(xué)家認(rèn)同，有些認(rèn)為證據(jù)還不夠，甚至認(rèn)為穿山甲有可能和人一樣是受害者之一。無(wú)論哪種結(jié)論，偷運(yùn)和食用穿山甲肯定不是好事。
2017年8月，廣西陸生野生動(dòng)物救護(hù)研究與疫源疫病監(jiān)測(cè)中心接收了走私入境的34只穿山甲，其中有32只活體，2個(gè)月后陸續(xù)發(fā)病和衰竭死亡。圖源：南國(guó)早報(bào)”微信公號(hào)”。
撰文 | 魏玉保 邸利會(huì)
編輯 | 陳曉雪
2月18日，香港大學(xué)管軼課題組與廣西醫(yī)科大學(xué)胡艷玲課題組合作的工作在論文預(yù)印網(wǎng)站bioRxiv上發(fā)布[1]，表明穿山甲很可能是新冠病毒從蝙蝠到人類(lèi)的中間宿主。
宏基因組測(cè)序確定了與穿山甲相關(guān)的冠狀病毒，在演化樹(shù)上屬于2019-nCoV（注：國(guó)際病毒分類(lèi)學(xué)委員會(huì)將引發(fā)此次疫情的病毒病名為SARS-CoV-2）相關(guān)冠狀病毒的兩個(gè)亞譜系，其中一個(gè)譜系在受體結(jié)合域中與2019-nCoV密切相關(guān)。宏基因組指環(huán)境樣本或組織樣本中全部微生物的基因組。
作者建議，穿山甲冠狀病毒的多個(gè)譜系與2019-nCoV相似表明，穿山甲應(yīng)被視為該新型人類(lèi)病毒的可能中間宿主，應(yīng)從潮濕的市場(chǎng)中移出以防止人畜共患病傳播。
截至目前，穿山甲是除了蝙蝠之外[2]，第二種被確認(rèn)其身上的冠狀病毒與2019-nCoV非常接近的哺乳動(dòng)物。
此前在1月23日，中科院武漢病毒研究所石正麗團(tuán)隊(duì)在bioRxiv發(fā)文，表明蝙蝠很可能是2019-nCoV的宿主。(Nature雜志在2月3日正式發(fā)表該論文，詳見(jiàn)賽先生之前的推送：石正麗最新研究：新冠肺炎患者早期病毒核算量更高)。
管軼實(shí)驗(yàn)室曾在2003年SARS爆發(fā)時(shí)，成功確定了冠狀病毒是SARS肺炎的病原體，為防控SARS疫情指明了正確方向。之后他追蹤了SARS冠狀病毒的傳染源來(lái)自于城市畜禽市場(chǎng)中的野生動(dòng)物。
在這篇論文中，管軼等人所用的穿山甲樣本為凍存組織，分別來(lái)自2017年8月到2018年1月廣西海關(guān)繳獲后，從廣西醫(yī)科大學(xué)獲得的馬來(lái)穿山甲（pangolins, Manis javanica）和2018年5月到7月從廣西醫(yī)科大學(xué)搜集的穿山甲樣本。
除了廣西繳獲的穿山甲，在2019年新型冠狀病毒暴發(fā)以后，廣州海關(guān)技術(shù)中心重新檢測(cè)了他們?cè)?019年3月反走私行動(dòng)中繳獲留存的5個(gè)穿山甲樣本。高通量的測(cè)序發(fā)現(xiàn)，鱗片上的樣本也有冠狀病毒，部分序列與2019-nCoV基因組有72%的相似性。
對(duì)此，香港大學(xué)管軼教授課題組專(zhuān)家說(shuō)：“現(xiàn)時(shí)并沒(méi)有科學(xué)根據(jù)病毒能在鱗片感染和繁殖，所以鱗片上提到核酸序列很大機(jī)會(huì)來(lái)自于旁邊的身體組織。我們?cè)谖恼律弦灿刑峒按擞^點(diǎn)?！?/p>
此外，廣東省生物資源應(yīng)用研究所和廣州動(dòng)物園發(fā)表于2019年10月的論文表明[3]，穿山甲是冠狀病毒的攜帶者。研究組也獲得了這一來(lái)源的穿山甲病毒序列的86%。
管軼實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，這些穿山甲冠狀病毒序列與人的2019-nCoV序列相似性達(dá)到了85.5-92.4%。
需要特別指出的是，在冠狀病毒受體結(jié)合域（RBD）氨基酸序列，文章提到的廣東穿山甲冠狀病毒與2019-nCoV的相似度是97%，而蝙蝠冠狀病毒RaTG與2019-nCoV相似度則比較低，是89.2%。不過(guò)，新冠病毒除了在受體結(jié)合域部分和廣東的序列有高度氨基酸序列相似外，剩余序列部分是和蝙蝠冠狀病毒RaTG13有更為緊密聯(lián)系。
有趣的是，作者通過(guò)深入的比較，發(fā)現(xiàn)穿山甲冠狀病毒在受體結(jié)合區(qū)域的非氨基酸編碼堿基上與新型冠狀病毒差別大，而與蝙蝠病毒RaTG13形成一小組，這在進(jìn)化上提示穿山甲冠狀病毒在這個(gè)區(qū)域重要氨基酸變化是進(jìn)化選擇的結(jié)果，而不是隨機(jī)的。
作者認(rèn)為，穿山甲冠狀病毒的受體結(jié)合域與2019-nCoV之間的氨基酸相似性可能是由于選擇性介導(dǎo)的趨同進(jìn)化而不是重組引起的，盡管很難在當(dāng)前數(shù)據(jù)的這些情況之間進(jìn)行選擇。
廣東省生物資源應(yīng)用研究所和廣州動(dòng)物園發(fā)表于2019年10月的論文表明[3]，穿山甲是冠狀病毒的攜帶者。另外，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)2月7日在其官方微信公眾號(hào)上[4]，透露穿山甲是新型冠狀病毒的攜帶者，但截至目前未見(jiàn)其論文發(fā)表。
對(duì)于武漢華南水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)中的新冠病毒源流，目前仍不明確。中國(guó)疾控中心在1月1日上午在此市場(chǎng)中取得500多份環(huán)境樣本，武漢病毒所在1月12日取得了約70份樣本，這兩批樣本中均有一定比例的樣本是新冠病毒陽(yáng)性。目前我們?nèi)狈@個(gè)市場(chǎng)中動(dòng)物組織樣本的數(shù)據(jù)。
找到宿主和中間宿主，有助于我們及時(shí)切斷傳播源，更好地防控傳染病。2004年年初，管軼通過(guò)檢測(cè)廣東省野生動(dòng)物市場(chǎng)中的病毒情況，幫助政府避免了SARS疫情的再次爆發(fā)。管軼在本篇論文中指出，不能排除穿山甲身上的病毒可能來(lái)自除了蝙蝠之外的其它哺乳動(dòng)物。這說(shuō)明了新冠病毒從動(dòng)物到人中間環(huán)節(jié)的復(fù)雜性。
馬來(lái)穿山甲（Manis javanica），又名爪哇穿山甲，主要分布于東南亞。走私及買(mǎi)賣(mài)穿山甲是違法行為。但是，每年數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的穿山甲被走私到中國(guó)，以作食療或中藥材。走私的起點(diǎn)一般是緬甸、馬來(lái)西亞等東南亞國(guó)家。如今，當(dāng)?shù)匾约爸袊?guó)的的穿山甲種群處于嚴(yán)重瀕危狀態(tài)。全球8種穿山甲均被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）物種紅色目錄列入瀕危級(jí)別以上，中國(guó)正在考慮將穿山甲由國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物提升至國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。
從東南亞到中國(guó)的野生動(dòng)物走私鏈條已經(jīng)形成多年[5]，目前我們對(duì)于這些野生動(dòng)物身上的病毒情況及其演化所知甚少。但廣東、廣西近年來(lái)零星發(fā)生的冠狀病毒感染，表明我們不能掉以輕心。關(guān)閉野生動(dòng)物交易市場(chǎng)，嚴(yán)查野生動(dòng)物買(mǎi)賣(mài)，是時(shí)候了！
香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院教授金冬燕評(píng)論說(shuō)：
很有意思，有提示性，但并沒(méi)有明確結(jié)論說(shuō)明三種病毒的進(jìn)化路線。不能說(shuō)SARS-CoV-2一定來(lái)自穿山甲，只能說(shuō)穿山甲中有類(lèi)似的病毒。
美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)圣安東尼奧醫(yī)學(xué)中心教授項(xiàng)焰評(píng)論說(shuō)：
這個(gè)研究很有意義。他們?cè)谧咚降拇┥郊咨厦姘l(fā)現(xiàn)了多種新的冠狀病毒，和現(xiàn)在的新冠病毒比較接近。雖然現(xiàn)在還無(wú)法確定這些穿山甲上的病毒來(lái)自于哪里以及這些病毒有沒(méi)有參與和別的病毒的重組造成現(xiàn)在的新冠病毒，這項(xiàng)研究告訴我們自然界中可能有很多還尚未發(fā)現(xiàn)的和新冠病毒類(lèi)似的病毒，而且穿山甲極有可能和這次新冠病毒的傳播有關(guān)。
賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系副研究員李懿澤評(píng)論：
這些新發(fā)現(xiàn)穿山甲冠狀病毒，跟新病毒的同源性不及石正麗發(fā)現(xiàn)的一株蝙蝠冠狀病毒，因此，從目前的數(shù)據(jù)看，穿山甲不太可能是新冠狀病毒的中間宿主。SARS-CoV-2很有意思的是它比其他親緣近的病毒多了furin切割位點(diǎn)，它的受體結(jié)合區(qū)，與整體基因組親緣更近蝙蝠冠狀病毒的相似度還不如整體親緣更遠(yuǎn)的穿山甲冠狀病毒，如果完全通過(guò)自然進(jìn)化獲得這些獨(dú)特性，非常不可思議。
美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)病毒與新發(fā)病原學(xué)中心主任劉善慮評(píng)論說(shuō)：
相對(duì)DNA病毒而言，RNA病毒的基因組序列變化多端。機(jī)制主要有二，一是基因突變，二是基因重組; 這是由RNA病毒編碼的RNA依賴(lài)性RNA聚合酶在病毒復(fù)制過(guò)程中不忠實(shí)容易錯(cuò)配造成的 - 說(shuō)得白話一點(diǎn)，就叫基因復(fù)制出軌。但RNA病毒重要的基因突變和重組并不是隨機(jī)的，而是有方向的，有選擇的?？梢韵胂瘢《究偸浅瘜?duì)它們有利的方向進(jìn)行突變，這就形成了病毒進(jìn)化?？梢哉f(shuō)，目前自然界存在的病毒都是在經(jīng)過(guò)了億萬(wàn)年的與宿主細(xì)胞進(jìn)行了持續(xù)不斷的戰(zhàn)爭(zhēng)而淘汰出來(lái)的精華。所以，人類(lèi)對(duì)付這些病毒也多顯吃力，包括最近的新型冠狀病毒。
這篇文章，以及最近類(lèi)似的幾篇，都表明武漢新型冠狀病毒有可能直接來(lái)源于穿山甲；但也不排除別的中間宿主。這是一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樵诓《灸さ鞍椎氖荏w結(jié)合區(qū)域，武漢新型冠狀病毒與來(lái)自穿山甲里的冠狀病毒有超過(guò)了97%的同源性。這個(gè)數(shù)字顯然超過(guò)任何一株目前已知的冠狀病毒，包括武漢病毒所最近分離的謠言中心蝙蝠病毒，RaTG13。有趣的是，作者通過(guò)深入的比較，發(fā)現(xiàn)穿山甲冠狀病毒在受體結(jié)合區(qū)域的非氨基酸編碼堿基上與新型冠狀病毒差別大，而與蝙蝠病毒RaTG13形成一小組，這在進(jìn)化上提示穿山甲冠狀病毒在這個(gè)區(qū)域重要氨基酸變化是進(jìn)化選擇的結(jié)果，而不是隨機(jī)的，其目的之一就是能更高效結(jié)合人的受體ACE2，從而達(dá)到傳染人和在人群中傳播的目的。其實(shí)這種現(xiàn)象在自然界和病毒學(xué)非常普遍，有時(shí)甚至是一個(gè)氨基酸的變化，就可以引起質(zhì)的飛躍。這種選擇多是來(lái)自宿主的免疫壓力，使病毒不得不變。
目前沒(méi)有解決的問(wèn)題是，武漢新型冠狀病毒在膜蛋白有一個(gè)特征性的4個(gè)氨基酸的連續(xù)插入，而這個(gè)插入在穿山甲以及目前已知的蝙蝠冠狀病毒中都不存在。然而，類(lèi)似序列在部分人的冠狀病毒，包括MERS是存在的，這提示新型冠狀病毒可能是穿山甲病毒與人的某些冠狀病毒的重組體。我們知道，這個(gè)特意性的氨基酸插入一般有利于病膜融合，而增加其感染性，所以新型冠狀病毒可能在進(jìn)化上結(jié)合了SARS和其他冠狀病毒的某些優(yōu)勢(shì)。至于新型冠狀病毒的實(shí)際毒力和傳播性能，以及與SARS病毒的比較，需要進(jìn)一步研究。
美國(guó)NIH研究學(xué)者王宇歌評(píng)論：
今天穿山甲的冠狀病毒序列終于被公布，SARS-CoV-2的起源有了重大突破，這個(gè)發(fā)現(xiàn)回答了很多的無(wú)端猜疑和傳言。我上周說(shuō)很希望看到穿山甲所攜帶的病毒基因組及S蛋白結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在這兩個(gè)研究數(shù)據(jù)終于都公布了。除了我已經(jīng)評(píng)價(jià)的McLellan組今天上線的Science的S蛋白結(jié)構(gòu)文章；今天bioRxiv上傳了汕頭大學(xué)-香港大學(xué)聯(lián)合病毒學(xué)研究所的preprint文章，報(bào)道了在馬來(lái)西亞穿山甲（Manis javanica）中冠狀病毒的鑒定結(jié)果。這個(gè)研究來(lái)自管軼組，采樣廣西和廣東海關(guān)在2017年至2019年3月截獲的非法販運(yùn)的馬來(lái)西亞穿山甲，所以結(jié)果非常客觀，它全面回答了病毒起源的諸多猜想。而該研究應(yīng)用了最新的宏基因組技術(shù)，發(fā)現(xiàn)穿山甲中的2個(gè)冠狀病毒亞型與SARS-CoV-2十分相似，其中一個(gè)亞型和SARS-CoV-2共有RBD的5個(gè)氨基酸殘基（http://t.cn/A6hod9GX ）。
研究首先檢測(cè)了2017年8月至2018年1月從18個(gè)馬來(lái)西亞穿山甲（Manis javanica）中收集的冷凍組織（肺，腸，血液）樣品。令人驚訝的是，其RNA-seq顯示43個(gè)樣本中的6個(gè)（2個(gè)肺組織樣品，2個(gè)腸道樣品，1個(gè)肺腸混合物樣品，1個(gè)血液樣品）中存在冠狀病毒。研究獲得6個(gè)完整或接近完整的病毒基因組序列—GX/P1E，GX/P2V，GX/P3B，GX/P4L，GX/P5E和GX/P5L，在進(jìn)化分析中，發(fā)現(xiàn)其與SARS-CoV-2親緣性很近。這些病毒基因組結(jié)構(gòu)與SARS-CoV-2類(lèi)似，具有9個(gè)開(kāi)放閱讀框。研究進(jìn)一步應(yīng)用Vero-E6培養(yǎng)系統(tǒng)分離出了病毒。由于這一實(shí)驗(yàn)體系的建立，研究設(shè)計(jì)出了相關(guān)PCR引物，進(jìn)一步鑒定了2018年5月至7月之間收集的另一批穿山甲樣品，在從12只穿山甲中測(cè)試的19個(gè)樣品（9個(gè)腸道樣品，10個(gè)肺組織樣品）中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)肺組織樣品冠狀病毒呈陽(yáng)性（除了來(lái)自廣西的動(dòng)物外，在COVID-19疫情爆發(fā)后，廣州海關(guān)技術(shù)中心重新檢查了他們?cè)谝郧暗慕孬@的5個(gè)儲(chǔ)存的穿山甲樣品）。
這些新的穿山甲冠狀病毒基因組與SARS-CoV-2有約85.5％至92.4％的基因序列同源性，它們形成了兩個(gè)進(jìn)化分支（亞型），其中之一（GD/P1L和GDP2S）與SARS-CoV-2密切相關(guān)。十分重要的發(fā)現(xiàn)是，研究判斷穿山甲冠狀病毒與著名的蝙蝠冠狀病毒RaTG13及SARS-CoV-2三者之間可能發(fā)生了重組。SARS-CoV-2與發(fā)現(xiàn)的穿山甲冠狀病毒S蛋白的受體結(jié)合結(jié)合域（RBD）具有97.4%氨基酸序列同源性；而RaTG13與SARS-CoV-2的RBD只有89.2%的氨基酸序列同源性。更重要的是，穿山甲冠狀病毒和SARS-CoV-2在RBD的5個(gè)關(guān)鍵殘基上具有相同的氨基酸殘基，而RaTG13僅與SARS-CoV-2共享1個(gè)氨基酸。這可以參見(jiàn)McLellan組S蛋白結(jié)構(gòu)文章（http://t.cn/A6hxelQU ）。由此作者推測(cè)，穿山甲冠狀病毒的RBD與SARS-CoV-2之間的氨基酸高度相似性可能是由于自然選擇介導(dǎo)的趨同進(jìn)化而不是重組引起的。
穿山甲是除蝙蝠以外唯一被SARS-CoV-2同類(lèi)冠狀病毒感染的哺乳動(dòng)物，本研究在穿山甲中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)相關(guān)的冠狀病毒亞型都與SARS-CoV-2高度同源。這表明這些哺乳動(dòng)物可能是此類(lèi)冠狀病毒的長(zhǎng)期宿主，但也不能排除穿山甲的冠狀病毒直接來(lái)源于蝙蝠。從東南亞到廣西和廣東的這條非法野生動(dòng)物的販運(yùn)途徑，可能是很多相關(guān)病毒傳染病的真正來(lái)源。因此這一研究提示處理這些動(dòng)物需要相當(dāng)謹(jǐn)慎，應(yīng)嚴(yán)格禁止在畜禽或水產(chǎn)市場(chǎng)中出售它們。
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4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)現(xiàn)穿山甲為新冠病毒潛在中間宿主http://www.bjnews.com.cn/news/2020/02/07/685655.html
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