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圖1  AcrVA4與LbCas12-crRNA結(jié)合的復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)

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原核生物通過(guò)一系列的防御系統(tǒng)來(lái)抵抗噬菌體等寄生生物的攻擊。與真核生物的免疫系統(tǒng)類似，原核生物的防御系統(tǒng)也可以分為天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)。天然免疫系統(tǒng)又包括限制性修飾（Restriction-Modification, R-M）系統(tǒng)、DNA干擾、毒素-抗毒素系統(tǒng)等，是非特異性的防御措施；而獲得性免疫系統(tǒng)是高度特異性的防御手段，其典型代表為CRISPR-Cas系統(tǒng)。近年來(lái)，針對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制研究取得了一系列重要進(jìn)展，這類系統(tǒng)的序列特異性核酸剪切活性能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞和生物的基因組進(jìn)行有效編輯，在基因工程和生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域顯示出了巨大應(yīng)用潛力。其中最受關(guān)注的是Cas9（type II）和Cas12a（type V）系統(tǒng)，二者都被設(shè)計(jì)和改造成高效精準(zhǔn)的基因編輯工具，而Cas13a（type VI）系統(tǒng)也被開(kāi)發(fā)成為高靈敏性的核酸檢測(cè)系統(tǒng)。 

為了逃逸宿主的CRISPR-Cas免疫作用，噬菌體也進(jìn)化出了多種anti-CRISPR（Acr）蛋白來(lái)抑制宿主菌體內(nèi)CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能。目前為止，研究人員已發(fā)現(xiàn)了一系列針對(duì)type I和type II CRISPR-Cas系統(tǒng)的Acr蛋白，并且其中多個(gè)Acr蛋白的抑制機(jī)理已被闡明，具有非常明顯的特異性和多樣性。2018年，Jennifer A. Doudna[1]和Joseph Bondy-Denomy[2]兩個(gè)課題組分別利用不同的方法發(fā)現(xiàn)了三個(gè)靶向type V效應(yīng)蛋白Cas12a的Acr蛋白（AcrVA1、AcrVA4、AcrVA5）并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)顯示出有效抑制活性。

隨后，Dong[3]等人發(fā)現(xiàn)AcrVA5通過(guò)對(duì)Cas12a進(jìn)行乙?；揎梺?lái)影響PAM基序的識(shí)別，從而抑制靶標(biāo)雙鏈DNA（dsDNA）的結(jié)合。同時(shí)，Knott[4]等人報(bào)道AcrVA1能夠剪切與Cas12a結(jié)合的CRISPR RNA (crRNA)的spacer序列，從而阻斷DNA靶標(biāo)鏈與crRNA互補(bǔ)配對(duì)；并且他們通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)證明了AcrVA4能夠影響靶標(biāo)DNA的結(jié)合，但其具體作用機(jī)理仍不清楚。此外，在這三個(gè)Acr蛋白中，AcrVA4具有最高的抑制效率，并且能同時(shí)抑制莫拉氏菌（Moraxella bovoculi, MbCas12a）和毛螺菌編碼的Cas12a（Lachnospiraceae bacterium, LbCas12a）蛋白活性，而LbCas12a已被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞的基因編輯。因此，揭示AcrVA4抑制Cas12a活性的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的基因編輯調(diào)節(jié)工具具有重要意義。 

通過(guò)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)AcrVA4能夠與LbCas12a-crRNA二元復(fù)合物以及切割前后兩種狀態(tài)的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元復(fù)合物結(jié)合，但是不能結(jié)合單純的Cas12a蛋白，表明AcrVA4識(shí)別Cas12a的特定構(gòu)象。隨后，他們利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)，解析了AcrVA4與LbCas12a-crRNA結(jié)合的原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示AcrVA4以同源二聚體形式存在，并且與一個(gè)或兩個(gè)LbCas12a-crRNA二元復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合。

圖2  AcrVA4抑制Cas12a活性的工作模型

在兩種形式的復(fù)合體中，AcrVA4通過(guò)類似的機(jī)制與Cas12a相互作用，表明兩種結(jié)合模式具有相同的抑制作用（圖1）。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析表明，AcrVA4利用其C端結(jié)構(gòu)域與LbCas12a的多個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用并鎖定其構(gòu)象，從而阻止靶標(biāo)DNA與crRNA的spacer序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而阻斷DNA切割反應(yīng)。有趣的是，當(dāng)AcrVA4與切割前狀態(tài)的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元復(fù)合物（R-loop狀態(tài)）相互作用時(shí)，能夠?qū)⒔Y(jié)合的dsDNA剝離下來(lái)，從而拯救被捕獲的靶標(biāo)DNA使其不被切割。此外，AcrVA4還能與切割后的LbCas12a-crRNA-dsDNA復(fù)合物結(jié)合并具有較高親和力，這可能會(huì)干擾Cas12a被新的crRNA重置，阻斷酶的循環(huán)利用過(guò)程（圖2）。 

該項(xiàng)工作系統(tǒng)地研究了AcrVA4抑制CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的分子機(jī)制。與其他已知Acr蛋白的單一抑制機(jī)制不同，AcrVA4能夠在反應(yīng)過(guò)程中的多個(gè)步驟影響Cas12a發(fā)揮活性。這些發(fā)現(xiàn)拓展了我們對(duì)于Acr蛋白作用機(jī)制的了解，為設(shè)計(jì)可調(diào)控的基因編輯系統(tǒng)提供了重要理論基礎(chǔ)。相關(guān)成果已在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）雜志在線發(fā)表，題為“Structural insight into multistage inhibition of CRISPR-Cas12a by AcrVA4”。 

文章鏈接：https://www.pnas.org/content/early/2019/08/28/1909400116

參考文獻(xiàn)：

　　1.Watters, K.E., et al., Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science, 2018. 362(6411): p. 236-239. 

　　2.Marino, N.D., et al., Discovery of widespread type I and type V CRISPR-Cas inhibitors. Science, 2018. 362(6411): p. 240-242. 

　　3.Dong, L.Y., et al., An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology, 2019. 26(4): p. 308-314. 

      4.Knott, G.J., et al., Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a. Nature Structural & Molecular Biology, 2019. 26(4): p. 315-321.