全面評估單堿基編輯技術(shù)mRNA脫靶風(fēng)險
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撰文 | 黃宇翔
責(zé)編 | 陳曉雪
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許多嚴(yán)重的疾病來自基因突變，因此基因編輯技術(shù)的進步為脊髓性肌營養(yǎng)不良、地中海貧血、視網(wǎng)膜黃斑變性等遺傳性疾病患者帶來了希望。[1]
但是，在將體細胞基因編輯技術(shù)向臨床推進、造?；颊叩牡缆飞?，研究者對技術(shù)潛在的安全性問題必須小心謹(jǐn)慎，在臨床試驗以前對風(fēng)險做充分的評估。脫靶效應(yīng)始終是懸掛在利用基因編輯技術(shù)進行疾病治療頭上的 “達摩克利斯之劍”?；蚓庉嫾夹g(shù)的脫靶效應(yīng)又可以細分為基因組和轉(zhuǎn)錄組兩個層面，此前的大量研究都關(guān)注于基因編輯技術(shù)在基因組層面對于DNA的脫靶效應(yīng)分析。[1-3]
在2019年6月10日上線的《自然》雜志上，中國神經(jīng)科學(xué)研究所的楊輝博士與其合作者，對于單堿基編輯技術(shù)（在CRISPR/Cas9 基礎(chǔ)上開發(fā)的一類基因編輯技術(shù)）在 mRNA 水平上的脫靶效應(yīng)進行了全面細致的分析，發(fā)現(xiàn)即使目前領(lǐng)域內(nèi)最先進的單堿基編輯工具 BE3 和ABE7. 10，也都存在不容忽視的 mRNA 脫靶效應(yīng)。楊輝團隊通過引入點突變的方法，對現(xiàn)有的單堿基編輯工具進行了改良，獲得了 mRNA 脫靶率較低的單堿基編輯工具。這一具有更高精度的工具，將為未來單堿基編輯工具應(yīng)用于臨床治療打下堅實的基礎(chǔ)。[4]
研究者以 HEK293T 細胞系為模型開展本項研究。通過對混合細胞和單細胞轉(zhuǎn)錄本進行測序分析，研究者發(fā)現(xiàn)表達單堿基編輯工具BE3和ABE7. 10都會顯著提升 mRNA 中突變的數(shù)目。對所引發(fā)的突變序列進行分析，研究者發(fā)現(xiàn)這些突變在一些原癌基因和抑癌基因中富集程度比較高，這意味著未來的研究者在試圖將單堿基編輯技術(shù)應(yīng)用于臨床時，需要對該技術(shù)誘發(fā)癌癥的風(fēng)險進行評估。[4]
為了降低現(xiàn)有工具的 mRNA 脫靶率，研究者通過突變優(yōu)化和嘗試人源結(jié)構(gòu)域的方法，獲得了具有高DNA編輯效率、低RNA脫靶率的BE3W90A、BE3 (hA3AR128A)、BE3(hA3AY130F)、ABE7. 10F148A等優(yōu)化版單堿基編輯工具。這些新工具能將檢測到的RNA突變率降低到與陰性對照相近的水平，其表現(xiàn)超過了此領(lǐng)域領(lǐng)軍科學(xué)家 David Liu 團隊和 Keith Joung團隊為降低mRNA脫靶率而獨立開發(fā)的優(yōu)化版本。[4-6]
不同于構(gòu)成基因組的 DNA，mRNA 在細胞中存在很多個拷貝，那為什么少數(shù)一些mRNA的異常會引起研究者如此高度的重視？“RNA的脫靶效應(yīng)會影響正常細胞的功能?！?該項研究的通訊作者楊輝告訴《知識分子》?！叭绻L期造成RNA的脫靶效應(yīng)，比如在AAV（腺相關(guān)病毒）介導(dǎo)的成體基因治療中”，細胞內(nèi)RNA的突變會影響細胞的正常生長，甚至可能會有致癌風(fēng)險。[7-9]
參考文獻：
[1] Reeset al., (2018) Base editing: precision chemistry on the genome andtranscriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. DOI: 10.1038/s41576-018-0059-1
[2]Zuo, E. et al., (2019) Cytosine base editor generates substantial off-targetsingle-nucleotide variants in mouse embryos. Science, DOI:10.1126/science.aav9973
[3]Jin,S. et al., (2019) Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wideoff-target mutations in rice. Science, DOI:10.1126/science.aaw7166
[4] Zhouet al., (2019) Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and itselimination by mutagenesis. Nature.
[5] Grünewaldet al., (2019) Transcriptome-wide off-target RNA editing induced byCRISPR-guided DNA base editors. Nature. DOI: 10.1038/s41586-019-1161-z
[6] Reeset al., (2019) Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adeninebase editors. Science Advance. DOI: 10.1126/sciadv.aax5717
[7]Villiger,L. et al., (2018) Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome baseediting in adult mice. Nat Med. DOI:10.1038/s41591-018-0209-1
[8]Rossidis,A. C. et al., (2018) In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolicgenes. Nat Med. DOI:10.1038/s41591-018-0184-6
[9]Maeder,M. L. et al., (2019) Development of a gene-editing approach to restore visionloss in Leber congenital amaurosis type 10. Nat Med. DOI:10.1038/s41591-018-0327-9
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