犬基因編輯與克隆
MSTN基因敲除犬“大力神”與“天狗”
撰文 | 王曉民（中科院廣州生物院）
2005年，世界首例體細(xì)胞克隆犬在韓國(guó)誕生。此后，轉(zhuǎn)基因克隆犬也相繼問(wèn)世。但是，關(guān)于犬基因敲除及基因敲除克隆的研究卻一直未有任何進(jìn)展。
近年來(lái)，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)興起，基因編輯效率的大幅度提高，使犬基因編輯與基因編輯克隆也相繼獲得成功。下面，讓我們來(lái)一起回顧一下犬基因編輯與克隆的歷程吧。
世界首例基因敲除犬
2014年6月底，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的賴良學(xué)研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合南京大學(xué)、廣州醫(yī)藥研究總院有限公司等單位，利用CRISPR/Cas9技術(shù)率先在犬基因組中實(shí)現(xiàn)基因敲除，成功構(gòu)建出世界首例基因（MSTN）敲除狗“大力神”與“天狗”。四個(gè)月時(shí)，“大力神”與“天狗”就表現(xiàn)出超強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，且“天狗”還具有明顯“雙肌”性狀。
2016年，賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)與北京希諾谷生物科技有限公司合作，繼續(xù)犬的基因編輯研究。此次研究的是一個(gè)與心血管疾病相關(guān)的基因APOE，用于構(gòu)建心血管疾病動(dòng)物模型。2016年12月29日世界首例動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型犬“蘋果”誕生。20天后，另一只APOE基因敲除犬“葫蘆”誕生。兩只APOE基因敲除犬都表現(xiàn)出血脂、膽固醇升高的癥狀。
世界首例基因敲除克隆犬
世界首例動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型犬“蘋果”誕生后，我們就展開對(duì)“蘋果”體細(xì)胞克隆的研究。2017年6月底，公安部南昌警犬基地收到兩只比格犬“蘋果”和“龍龍”血液樣本，經(jīng)DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，“龍龍”與“蘋果”同一認(rèn)定幾率大于99.99%，排除與代孕母犬親子關(guān)系。
同時(shí)，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院（簡(jiǎn)稱生物院）賴良學(xué)研究員團(tuán)隊(duì)，對(duì)“龍龍”與“蘋果”APOE基因進(jìn)行了鑒定，其基因敲除方式完全一致。這意味著，這兩只狗狗應(yīng)該是同一只！其中一只狗完全由另一只克隆而來(lái)——“龍龍”是“蘋果”的“翻版”。它不僅是中國(guó)首例完全自主培育的體細(xì)胞克隆犬，也是世界首例基因編輯克隆犬。
基因敲除克隆犬“龍龍”、“希希”、“諾諾”
基因編輯與克隆技術(shù)的完美結(jié)合
什么是基因編輯技術(shù)呢？基因編輯指能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、敲入等的技術(shù)。在過(guò)去幾年中, 以ZFN (zinc-finger nucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)為代表的序列特異性核酸酶技術(shù)以其能夠高效率地進(jìn)行定點(diǎn)基因組編輯, 在基礎(chǔ)研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。而CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就有著其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。
隨著技術(shù)不斷改進(jìn)，能夠在活細(xì)胞中“編輯”任何基因的技術(shù)中，它更被認(rèn)為是最有效、最便捷的。研究人員目前已成功在狗、牛、羊、豬、兔、小鼠、大鼠等動(dòng)物及人類胚胎中實(shí)現(xiàn)基因編輯。而說(shuō)到“克隆”這個(gè)詞，很多人會(huì)想到世界上第一例運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)培育出的動(dòng)物——克隆羊“多莉”。
克隆羊多莉
“多莉”的誕生，標(biāo)志著生物體通過(guò)體細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖的克隆技術(shù)成為現(xiàn)實(shí)。隨后，克隆豬、牛等紛紛問(wèn)世，克隆犬直至2005年才問(wèn)世。犬被科學(xué)界普遍認(rèn)為是最難克隆的動(dòng)物之一。該領(lǐng)域的技術(shù)一直被韓國(guó)所壟斷。而基因編輯與克隆技術(shù)相結(jié)合，我們認(rèn)為具有廣泛的運(yùn)用前景。這項(xiàng)技術(shù)在品種改良、疾病研究、生物醫(yī)藥等方面都具有巨大的價(jià)值。
犬基因編輯與克隆為何如此困難
21年前，克隆羊“多莉”誕生，震動(dòng)世界。而后，克隆牛、克隆豬等克隆動(dòng)物，陸續(xù)誕生，但對(duì)克隆犬，此前卻鮮有聞之。克隆犬的首要難題是成熟卵母細(xì)胞的獲取。
克隆包括三個(gè)主要的技術(shù)環(huán)節(jié)：
一是成熟卵母細(xì)胞的獲取及卵母細(xì)胞去核；
二是克隆胚胎制備；
三是克隆胚胎的移植。
成熟卵母細(xì)胞的獲取有兩個(gè)途徑：
體外成熟培養(yǎng)；
體內(nèi)成熟獲取。
例如豬、牛、羊等動(dòng)物，可以去屠宰場(chǎng)獲取被屠宰牲畜的卵巢，從卵巢的卵泡中取出未成熟的卵母細(xì)胞。經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，并可用于后續(xù)的體細(xì)胞克隆。犬卵母細(xì)胞從卵泡中排出后處于GV期，是未成熟的卵子，需在輸卵管中停留48-72小時(shí)到達(dá)成熟期（MⅡ）。而體外成熟培養(yǎng)效率極低，幾乎無(wú)法滿足克隆需求，因此只能通過(guò)體內(nèi)成熟的方法，獲取體內(nèi)成熟卵子，用于犬的體細(xì)胞克隆。
犬的發(fā)情周期長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月，發(fā)情期持續(xù)10-15天，但排卵后從卵母細(xì)胞成熟到老化的間隔時(shí)間較短。因此，獲取成熟且質(zhì)量好的卵母細(xì)胞窗口期非常短。這就要求研究人員準(zhǔn)確判斷犬的排卵及卵子成熟的時(shí)間，才能獲得處于理想狀態(tài)的卵子用于克隆胚胎的制備。一旦錯(cuò)過(guò)卵子成熟的時(shí)間，下次排卵，就要等半年甚至一年。一只狗平均排卵7-8枚，手術(shù)取卵時(shí)間過(guò)早，卵子沒(méi)有成熟；取卵子時(shí)間過(guò)晚，卵子又老化。甚至同一只狗也會(huì)出現(xiàn)沖出的卵子有的成熟，有的未成熟。正是由于犬的這種特殊生殖生理特點(diǎn)，使得犬基因編輯與體細(xì)胞克隆尤其困難。
來(lái)源：中科院廣州生物院 ，經(jīng)授權(quán)轉(zhuǎn)載。
