有了“基因魔剪”的育種新方案，種質(zhì)的多樣性有救了
?圖1，番茄品種有著大量的遺傳多樣性（圖片來(lái)自www.fromfilmerstofarmers.com）
撰文 | 汪鴻儒（遺傳學(xué)博士）
責(zé)編 | 陳曉雪
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對(duì)于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，人們一直有著兩個(gè)最為重要的期待：在生命健康領(lǐng)域，幫助治療疾?。辉谵r(nóng)業(yè)領(lǐng)域，用于育種。最近，美國(guó)冷泉港一實(shí)驗(yàn)室主導(dǎo)的一項(xiàng)研究（Rodriguez-Lealet al., 2017），為基于基因編輯的分子育種提供了一個(gè)令人振奮的解決方案。在這篇發(fā)表在《細(xì)胞》的文章中，研究人員通過(guò)對(duì)影響番茄果實(shí)大小、花序結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)習(xí)性三個(gè)性狀的順式調(diào)節(jié)元件的編輯，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這些復(fù)雜數(shù)量性狀的精細(xì)操控。并通過(guò)簡(jiǎn)單的遺傳設(shè)計(jì)，在受體品種中迅速固定目標(biāo)性狀。這一研究不僅大大擴(kuò)展了育種上可用的自然變異，也為解析基因調(diào)控變化和數(shù)量性狀間復(fù)雜關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。鑒于新的方案很容易地在其他作物甚至動(dòng)物中推廣開(kāi)來(lái)，在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，一場(chǎng)農(nóng)業(yè)育種和數(shù)量遺傳學(xué)研究的革命即將爆發(fā)。
番茄好吃又高產(chǎn)可不容易
提高番茄的產(chǎn)量，有兩個(gè)方向：讓單個(gè)番茄長(zhǎng)得更大，或者讓一株番茄上掛更多果實(shí)。對(duì)于這兩個(gè)特征，科學(xué)術(shù)語(yǔ)為性狀，簡(jiǎn)單稱之為果實(shí)大小和果實(shí)數(shù)目的性狀。在自然界中，番茄存在著大量的遺傳多樣性，僅在世界蔬菜中心的資源庫(kù)中，就收藏了7000多份不同的野生和栽培番茄品種（圖1）。當(dāng)然，我們關(guān)心的果實(shí)大小和果實(shí)數(shù)目?jī)蓚€(gè)性狀，也會(huì)呈現(xiàn)出多樣性（圖2和圖3）。育種學(xué)家們首先會(huì)對(duì)種質(zhì)資源庫(kù)進(jìn)行篩選和鑒定，例如，尋找一個(gè)果實(shí)大的番茄品種，通過(guò)雜交，將果實(shí)大的性狀引入到好吃的番茄品種，再通過(guò)選育，最終獲得又好吃又大的番茄。
? 圖2. 不同番茄品種在掛果數(shù)量性狀上表現(xiàn)出很大的遺傳變異 （Park et al. 2014）
遺憾的是，只有在最理想的狀況下，上面的技術(shù)路線才會(huì)按照預(yù)期實(shí)現(xiàn)目標(biāo)。大多情況下，總會(huì)有一些我們不喜歡的性狀與果實(shí)大小性狀相伴，如番茄變大了，但味道也變差了，或者新的番茄品種更容易生病了。育種學(xué)家想對(duì)原有好吃的番茄品種進(jìn)行一次“干凈的系統(tǒng)升級(jí)”，并非想象的那么簡(jiǎn)單！
性狀調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)和“調(diào)節(jié)器”
遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，性狀是由基因控制的。過(guò)去一百多年，分子遺傳學(xué)家們一直試圖弄清楚類似番茄果實(shí)大小這種性狀是由哪些基因控制的，這些基因之間又是如何相互作用并影響到番茄風(fēng)味的。弄清了這些，科學(xué)家們就可以從基因?qū)用?，把只影響果?shí)大小的部分摘出來(lái)放到受體品種中，在品種改良時(shí)就可以實(shí)現(xiàn)“干凈的升級(jí)”了！
經(jīng)過(guò)不同領(lǐng)域分子遺傳學(xué)家們的辛勤工作，生物性狀分子基礎(chǔ)及組織形式的神秘面紗已經(jīng)揭開(kāi)。人們發(fā)現(xiàn)，每個(gè)性狀實(shí)際上都是由一個(gè)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)在調(diào)控，而網(wǎng)絡(luò)上的每一個(gè)節(jié)點(diǎn)就是一個(gè)基因。番茄果實(shí)大小性狀也不例外，它由一個(gè)復(fù)雜到令人頭疼的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著，風(fēng)味性狀也一樣。糟糕的是，這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)是交織在一起的，并又聯(lián)到控制其他性狀的網(wǎng)絡(luò)上，從而形成一個(gè)更大更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。這是一個(gè)壞消息，因?yàn)槿绻茐牧斯麑?shí)大小分子網(wǎng)絡(luò)上的一個(gè)基因，可能就會(huì)波及到調(diào)控果實(shí)風(fēng)味的網(wǎng)絡(luò)，影響口味。正所謂牽一發(fā)而動(dòng)全身！但好消息是，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在這個(gè)巨大網(wǎng)絡(luò)上，幾乎每個(gè)節(jié)點(diǎn)基因上都設(shè)有各種“調(diào)節(jié)器”。有一類“調(diào)節(jié)器”，叫做順式調(diào)節(jié)元件（cis-regulatory element），它們對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)實(shí)行著精細(xì)而又準(zhǔn)確的微調(diào)。它們控制著基因表達(dá)量的大小和基因的剪接形式；也可以接收另一類關(guān)鍵調(diào)控子——轉(zhuǎn)錄因子（或者稱作反式調(diào)節(jié)元件，trans-regulatory element）下達(dá)的指令，讓基因在特定的時(shí)間、特定的組織并以特定的量表達(dá)。一個(gè)“調(diào)節(jié)器”，往往可以對(duì)應(yīng)一個(gè)特異的表型，因而實(shí)現(xiàn)對(duì)性狀的模塊化管理。也就是說(shuō)，順式調(diào)節(jié)元件像一個(gè)個(gè)功能專一的零件，當(dāng)你改變順式調(diào)節(jié)元件的時(shí)候，可以實(shí)現(xiàn)只對(duì)一個(gè)性狀的特異性的調(diào)節(jié)，而這個(gè)正是我們想要的！
分子育種家們非常青睞這些“調(diào)節(jié)器”，在不同品種番茄的基因組中，這些“調(diào)節(jié)器”的版本不同，會(huì)造成信號(hào)的強(qiáng)弱不同，最終映射到性狀上，表現(xiàn)出來(lái)性狀的多樣性。以番茄的大小為例，它的一個(gè)調(diào)節(jié)器位于一個(gè)名叫fasciated基因的內(nèi)含子上。在兩個(gè)不同的番茄品種中，這一“調(diào)節(jié)器”的差異，就導(dǎo)致了fasciated基因表達(dá)量的不同，最終造成番茄果實(shí)大小的差異（圖3）（Conget al., 2008）。對(duì)于好吃的番茄，我們對(duì)它基因組上的“調(diào)節(jié)器”做一下調(diào)換，就可以育出又好吃又大的番茄品種啦！
?圖3. 不同番茄品種在果實(shí)大小性狀上表現(xiàn)出的多樣性，fasciated基因內(nèi)含子區(qū)域的序列變異貢獻(xiàn)了這一性狀的差異（Conget al. 2008）
不過(guò)，目前的這套分子育種系統(tǒng)也有它的不足。第一，它依賴于自然界現(xiàn)有的調(diào)節(jié)元件的變異。在fasciated基因的例子中，我們幸運(yùn)地在自然界發(fā)現(xiàn)了某一個(gè)版本的調(diào)節(jié)元件，正好可以“調(diào)制”出大個(gè)的番茄，如果自然界沒(méi)有這一版本的調(diào)節(jié)元件呢？第二，要實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組上一個(gè)零件的調(diào)換，一般采用的是雜交的方式，需要很多代，因此這個(gè)育種系統(tǒng)非常耗時(shí)。而冷泉港科學(xué)家采用CRISPR-Cas9“基因魔剪”技術(shù)，巧妙地破解了這兩個(gè)難題，從而釋放了這一育種系統(tǒng)的無(wú)窮潛力。
快速產(chǎn)生變異的一體化操作
冷泉港Lippman實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家首先瞄準(zhǔn)lc和fasciated兩個(gè)基因，它們分別控制著果實(shí)形狀和大小這兩個(gè)數(shù)量性狀。針對(duì)它們的順式調(diào)節(jié)元件區(qū)域，設(shè)計(jì)多個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，產(chǎn)生了不同的DNA序列變異，也造成了不同的表型效果。為了在后代中獲得更加多的新變異，研究者采用了一個(gè)非常聰明的設(shè)計(jì)：他們將第一步獲得的嚴(yán)重功能缺失的番茄植株和正常的番茄雜交。如此，在它們的后代群體中，一方面它們攜帶了CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)基因，另一方面攜帶了目標(biāo)基因的雜合形式。通過(guò)后代的分離，就會(huì)快速產(chǎn)生大量的、一系列目標(biāo)基因突變的植株，對(duì)應(yīng)到表型，會(huì)有著連續(xù)型的變異，其中有一些變異是很微小的。在fasciated基因的例子中，他們鑒定了1000多個(gè)雜交后代，其中將近一半攜帶了CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)基因，而攜帶轉(zhuǎn)基因的植株中又有一半產(chǎn)生了表型的差異。通過(guò)PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，這些植株的基因組在目標(biāo)區(qū)域確有新DNA變異產(chǎn)生。最后，通過(guò)對(duì)這些含有變異的番茄進(jìn)行自交，可以很快地固定新變異，并且去除CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因。另外一個(gè)基因控制開(kāi)花時(shí)間和生長(zhǎng)習(xí)性的基因SP，它在自然界的現(xiàn)有變異形式較少。研究者也采用類似的思路，對(duì)其順式調(diào)節(jié)元件區(qū)域進(jìn)行編輯，“生產(chǎn)”了一系列株型的變異，而其中不乏應(yīng)用上優(yōu)異的變異（圖4），為育種創(chuàng)造了豐富的可用“零件”。
?圖4. SP基因啟動(dòng)子區(qū)不同的等位變異產(chǎn)生一系列的植物株型的多樣性（Rodriguez-Leal et al. 2017）
這一育種方案重要特點(diǎn)是，直接對(duì)受體品種中的目標(biāo)基因（如控制番茄大小的基因）進(jìn)行編輯，可以快速大量產(chǎn)生一系列變異，然后從后代中鑒定篩選出理想的株系。這是一套產(chǎn)生新變異、在目標(biāo)品種中整合新變異的一體化操作，避免了從其他株系導(dǎo)入基因的耗時(shí)步驟，大大縮短了育種周期。
種質(zhì)多樣性有救了
“發(fā)掘自然界新變異，整合有利變異”是長(zhǎng)達(dá)近萬(wàn)年作物馴化的主題，也是現(xiàn)代育種研究的主要思路，但它依賴于本物種現(xiàn)有的遺傳多樣性。而遺傳多樣性的基礎(chǔ)——豐富的自然變異，是靠本物種的群體在長(zhǎng)達(dá)數(shù)萬(wàn)甚至數(shù)百萬(wàn)年的時(shí)間里產(chǎn)生，并歷經(jīng)一系列群體事件，而最終保留至今。隨著全球人口增長(zhǎng)，人的生存空間和生態(tài)環(huán)境之間的沖突加劇，這些物種種群遭到破壞，多樣性也會(huì)不斷丟失?？茖W(xué)家們?cè)谌蚪⒘嗽S多重要作物的種質(zhì)資源庫(kù)，大大延緩了全球物種多樣性的丟失。但是，放在種子庫(kù)中的種子，又失去了隨著環(huán)境變化不斷產(chǎn)生新變異的機(jī)會(huì)。
Lippman實(shí)驗(yàn)室的育種設(shè)計(jì)規(guī)避了這些問(wèn)題，大大突破了“物種現(xiàn)有自然變異”的限制；另一方面，也避免了在自然變異的汪洋大海中尋找優(yōu)異變異的操作，而是針對(duì)特異的基因組靶點(diǎn)，自行創(chuàng)造育種所需新變異。
突破“物種現(xiàn)有自然變異”限制，除了育種上的巨大價(jià)值，也為數(shù)量遺傳學(xué)研究帶來(lái)了前所未有的契機(jī)。自然界中現(xiàn)有基因變異，往往都是自然選擇的結(jié)果，不適應(yīng)環(huán)境的變異已經(jīng)被剔除。實(shí)際上，那些“不適應(yīng)”的變異，對(duì)于數(shù)量遺傳學(xué)研究卻是寶貴的材料。Lippman實(shí)驗(yàn)室的這一研究通過(guò)在順式轉(zhuǎn)錄元件位置創(chuàng)造大量突變，從而制造出調(diào)控效果不同的等位變異，進(jìn)而對(duì)數(shù)量性狀的分子網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生不同的調(diào)控作用，產(chǎn)生不同的表型。通過(guò)大量創(chuàng)造DNA變異以及對(duì)應(yīng)不同表型這一對(duì)“輸入”和“輸出”，研究者可以系統(tǒng)評(píng)估順式調(diào)節(jié)元件的功能，研究它們參與的分子模塊以及時(shí)空組織形式。無(wú)疑，Lippman實(shí)驗(yàn)室的這一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的工作，將幫助植物學(xué)家再次引領(lǐng)數(shù)量遺傳學(xué)的研究。
參考文獻(xiàn)：
Cong, B., Barrero, L.S., and Tanksley, S.D. (2008). Regulatory change inYABBY-like transcription factor led to evolution of extreme fruit size during tomato domestication. Nat Genet 40, 800-804.
Park, S.J., Jiang, K., Tal, L., Yichie, Y., Gar, O., Zamir, D., Eshed,Y., and Lippman, Z.B. (2014). Optimization of crop productivity in tomato using induced mutations in the florigen pathway. Nat Genet 46, 1337-1342.
Rodriguez-Leal, D., Lemmon, Z.H., Man, J., Bartlett, M.E., and Lippman,Z.B. (2017). Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing. Cell 171, 470-480 e478.
