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線粒體基因也能編輯了，距離治病還有多遠(yuǎn)？

2020/07/21
導(dǎo)讀
第一例線粒體DNA精確編輯的分子工具

Credit：ANGELA GAO


撰文 | 秦芳菲
責(zé)編 | 湯佩蘭

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2020年7月14日，由哈佛大學(xué)布羅德研究所化學(xué)生物學(xué)家劉如謙（David  R.Liu）與華盛頓大學(xué)微生物學(xué)家 Joseph Mougous 合作有關(guān)基因編輯論文在《自然》發(fā)表，開(kāi)發(fā)出了 “第一例線粒體DNA精確編輯的分子工具” [1]。
 
“該工具在人體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮了作用，可能開(kāi)啟一扇新的研究之門(mén)，以及未來(lái)數(shù)十種難以治療的由線粒體 DNA (mtDNA)突變引起的疾病的新療法?！?/span>《科學(xué)》雜志對(duì)該技術(shù)評(píng)價(jià)道 [2]。

過(guò)去幾年，圍繞 CRISPR 研究，David Liu 在堿基編輯范圍，對(duì)特異性，精確性和體內(nèi)遞送方向均作出了顯著進(jìn)展，并在基因編輯治療疾病方向也有深入研究 [3][4]。
 
但目前 CRISPR 技術(shù)都是進(jìn)入細(xì)胞核中，改造染色體 DNA，可能用于治療細(xì)胞核遺傳物質(zhì)突變導(dǎo)致的疾病。對(duì)于人類(lèi)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，不只細(xì)胞核中有 DNA，細(xì)胞質(zhì)的線粒體也存在 DNA，這些基因突變同樣會(huì)造成遺傳病。


圖1 線粒體 圖源lifespan[5]

 
線粒體內(nèi)的DNA編碼13種蛋白質(zhì)，雖然種類(lèi)不多，但每一種都參與到細(xì)胞的能量供應(yīng)鏈中。線粒體DNA突變可能導(dǎo)致數(shù)十種代謝疾病，包括心肌病、Leber 遺傳性視神經(jīng)病變等，而且這些疾病至今沒(méi)有治愈方法。開(kāi)發(fā)可以精確糾正線粒體DNA的基因編輯工具，將為治療這類(lèi)疾病打開(kāi)大門(mén)。
 
CRISPR 系統(tǒng)需要有一段向?qū)?RNA（gRNA）定位到基因組特定位置，而RNA是不能夠進(jìn)入線粒體的（圖2）。因此，目前改造線粒體DNA的方法主要利用無(wú)RNA系統(tǒng)的核酸酶，包括轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和鋅指核酸酶（ZFN）（注：CRISPR、TALEN和ZFN為基因組編輯三大技術(shù)）融合到線粒體靶向信號(hào)序列上，引發(fā)環(huán)狀線粒體DNA 雙鏈斷裂成線性化的 DNA，再對(duì) DNA 進(jìn)行編輯。然而，線性化的線粒體 DNA 往往還沒(méi)有來(lái)得及修復(fù)就被迅速降解，從而容易引發(fā)不易被切斷的線粒體基因組的不均衡分布，細(xì)胞分裂過(guò)程造成異質(zhì)性。鑒于此方法不能用于改變線粒體 DNA 特定堿基，因易導(dǎo)致DNA降解也不能用于同質(zhì)線粒體 DNA 突變，而應(yīng)用受限。


圖2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)需要gRNA （圖源Thermo）


在研究細(xì)菌之間如何用毒素相互攻擊時(shí)，Mougous 與同事有一個(gè)偶然發(fā)現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，這些毒素屬于細(xì)菌脫氨酶，它們往往通過(guò)識(shí)別單鏈DNA（ssDNA）、RNA、游離核苷、核苷酸、核酸堿基或者其他的核苷酸衍生物，而不識(shí)別雙鏈 DNA（dsDNA）。因此，當(dāng)科學(xué)家們研究新型毒素的作用時(shí)，往往用 dsDNA 作為對(duì)照。意外的是，他們發(fā)現(xiàn)了這種新型的細(xì)菌脫氨酶，雖然對(duì) ssDNA 沒(méi)有效果，但是可以直接修改對(duì)照組 dsDNA 上的堿基，把其中的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（U），從而殺死細(xì)菌（圖3）。于是，他們將這種細(xì)菌毒素命名為 DddA (double-stranded DNA deaminase toxin A，雙鏈DNA脫氨酶毒素A)。

 
圖3 以往的細(xì)菌脫氨酶作用于單鏈DNA，不切割雙鏈DNA，而新發(fā)現(xiàn)的DddA可以切割雙鏈DNA，而對(duì)單鏈DNA無(wú)效
 
不過(guò)，這種細(xì)菌毒素對(duì)于人體細(xì)胞是有毒的，如果不加以控制，它將肆意破壞 DNA，將遇到的所有胞嘧啶（C）都進(jìn)行突變。為了使其可以進(jìn)行精準(zhǔn)的線粒體 DNA 編輯而不對(duì)細(xì)胞造成損傷，科學(xué)家們?cè)O(shè)想了巧妙的辦法：他們找到毒性結(jié)構(gòu)域 DddAtox，根據(jù)結(jié)晶得到的 DddAtox 的活性口袋，將它一分為二，變成沒(méi)有活性的兩個(gè)片段，只有當(dāng)它們到達(dá)特定位置后彼此融合，才恢復(fù)脫氨酶功能（圖4）。David Liu 將其稱(chēng)之為 “馴服野獸” 的過(guò)程。
 

圖4 分割為N端和C端部分的DddAtox，只有當(dāng)融合后，才能行使功能

 
接下來(lái)，在模式細(xì)胞人類(lèi)人胚胎腎細(xì)胞 HEK293T 中，研究人員證實(shí)了DdCBE系統(tǒng)的編輯能力。他們測(cè)試了線粒體基因組中的5個(gè)基因，處理3~6天后，堿基編輯效率在4.6%~49%（圖5），脫靶效應(yīng)基本也在0.05%以下。
 
圖 5 DdCBE系統(tǒng)的編輯能力
 
Mootha 表示，“這是我的職業(yè)生涯中首次實(shí)現(xiàn)線粒體 DNA 的精準(zhǔn)編輯，這是一次質(zhì)的飛躍。如果我們可以實(shí)現(xiàn)靶向突變，我們就可以開(kāi)發(fā)疾病相關(guān)突變的研究，并發(fā)展有效的治療藥物?！?[6] 不過(guò)，David Liu 對(duì)《自然》雜志表示，這距離應(yīng)用到臨床還有很長(zhǎng)的路要走，其他類(lèi)型的細(xì)胞還有待研究 [7]。
 
據(jù)《自然》雜志報(bào)道，這種技術(shù)彌補(bǔ)了現(xiàn)有治療線粒體疾病的方法。目前，英國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了 “線粒體置換” 的方法，將卵細(xì)胞或者胚胎細(xì)胞中的線粒體置換為健康供體的卵細(xì)胞或者胚胎細(xì)胞的線粒體。劍橋大學(xué)線粒體遺傳學(xué)家 Michal Minczuk 表示，這種新型的編輯技術(shù)將使研究者們能夠糾正錯(cuò)誤的突變，即使線粒體中沒(méi)有足夠的數(shù)目的DNA拷貝數(shù)。盡管真正的醫(yī)用還很遙遠(yuǎn)，但是短期看來(lái)，研究者們就已經(jīng)可以通過(guò)利用該技術(shù)生成動(dòng)物模型，來(lái)研究線粒體突變的影響 [7]。

 參考資料

[1]Mok, B. Y.;  de Moraes, M. H.;  Zeng, J.;  Bosch, D. E.;  Kotrys, A. V.; Raguram, A.;  Hsu, F.;  Radey, M. C.;  Peterson, S. B.;  Mootha, V. K.; Mougous, J. D.; Liu, D. R., A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 2020. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4

[2]https://www.sciencemag.org/news/2020/07/new-method-edit-cell-s-powerhouse-dna-could-help-study-variety-genetic-diseases

[3]Yeh, W.-H.;  Chiang, H.;  Rees, H. A.;  Edge, A. S. B.; Liu, D. R., In vivo base editing of post-mitotic sensory cells. Nature Communications 2018, 9 (1), 2184.

[4]Shen, M. W.;  Arbab, M.;  Hsu, J. Y.;  Worstell, D.;  Culbertson, S. J.;  Krabbe, O.;  Cassa, C. A.;  Liu, D. R.;  Gifford, D. K.; Sherwood, R. I., Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature 2018, 563 (7733), 646-651.

[5]The First Precision Gene Editing Tool for Mitochondrial DNA. https://www.lifespan.io/news/the-first-precision-gene-editing-tool-for-mitochondrial-dna/

[6]New molecular tool precisely edits mitochondrial DNA. https://www.sciencedaily.com/releases/2020/07/200708121436.htm

[7]Scientists make precise gene edits to mitochondrial DNA for first time. https://www.nature.com/articles/d41586-020-02054-5

 
 制版編輯 | 皮皮魚(yú)
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