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?錢永健。來(lái)源：hhmi

撰文 | 吳建永（美國(guó)喬治城大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)系教授）

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錢永健教授突然辭世，消息瞬間刷屏。錢的主要貢獻(xiàn)是“點(diǎn)亮了生物學(xué)”。他獲得諾貝爾獎(jiǎng)的工作是開發(fā)熒光蛋白，但業(yè)內(nèi)人認(rèn)為他還有更重要，更值得獲獎(jiǎng)的貢獻(xiàn)。但這沒有關(guān)系，諾貝爾獎(jiǎng)也是外行夸獎(jiǎng)內(nèi)行。愛因斯坦不也沒有因?yàn)橄鄬?duì)論獲獎(jiǎng)嗎？下面講幾個(gè)小故事，幫大家捋順一下怎樣“點(diǎn)亮了”生物學(xué)，點(diǎn)亮為什么重要。

所謂“點(diǎn)亮了”生物學(xué)，就是讓少數(shù)細(xì)胞在數(shù)億細(xì)胞組成的系統(tǒng)中里亮起來(lái)，或者某些分子在細(xì)胞億萬(wàn)個(gè)分子中亮起來(lái)。亮起來(lái)就能看見，從而結(jié)束了生物學(xué)家的“瞎摸”時(shí)代。

舉個(gè)例子，數(shù)以億計(jì)的神經(jīng)細(xì)胞默默地在神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)部門工作。神經(jīng)細(xì)胞緊緊地?cái)D在一起，像森林里的大樹那樣枝叉互相交織纏繞。在枝杈頂端，不同的神經(jīng)細(xì)胞相互接觸并傳遞信息。腦子能想事情，關(guān)鍵就靠神經(jīng)細(xì)胞之間錯(cuò)綜交織的聯(lián)系。在大腦皮層里， 每個(gè)神經(jīng)細(xì)胞大約要把信息送給幾千個(gè)其他細(xì)胞，同時(shí)每個(gè)細(xì)胞也要接受并處理從幾千個(gè)神經(jīng)細(xì)胞來(lái)的信息?？墒巧窠?jīng)細(xì)胞之間的相互聯(lián)確是很難看清楚的，就像在飛機(jī)上用望遠(yuǎn)鏡看森林，雖然可以看見樹，但是當(dāng)樹枝交叉在一起的時(shí)候，就只能看見一片蔥綠，而分不清哪枝來(lái)自哪棵樹。因此在普通顯微鏡下腦組織看起來(lái)就像肉凍，分不清單個(gè)的神經(jīng)細(xì)胞，只能模模糊糊地看到一些由于神經(jīng)細(xì)胞整齊排列形成的層狀結(jié)構(gòu)。如果一個(gè)或一類細(xì)胞亮了起來(lái)，就可以大大幫助腦的研究。

錢教授的主要貢獻(xiàn)就是：

1. 開發(fā)了一種方法，讓正在活動(dòng)的神經(jīng)細(xì)胞亮起來(lái)（鈣成像）；

2. 開發(fā)了熒光蛋白，讓實(shí)驗(yàn)者可以按需要把讓不同的神經(jīng)細(xì)胞按其特征發(fā)光（圖一）。

?圖一  用腦彩虹技術(shù)拍攝的神經(jīng)細(xì)胞。圖中彩色圓圈是神經(jīng)細(xì)胞胞體，胞體連接的樹枝狀結(jié)構(gòu)是細(xì)胞的突觸。由于每個(gè)細(xì)胞都有一個(gè)獨(dú)特的顏色，可以利用圖像處理技術(shù)把相互交叉的突觸看清。來(lái)源：wired.co.uk

那么怎樣讓蛋白或其他生物大分子出現(xiàn)彩色的熒光呢？這是一個(gè)深刻的問題。用熒光蛋白標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞是研究大腦的一項(xiàng)重要的工具。因此在最近二十多年以來(lái)開發(fā)不同顏色的熒光蛋白，并提高熒光的亮度就成了神經(jīng)科學(xué)研究中的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。

先簡(jiǎn)單講講熒光的原理：我們知道原子周圍環(huán)繞著電子云。電子云攜帶的能量隨其形狀不同而變化。電子云可以和光子相互作用，吸收一個(gè)光子而變成帶有更高能量的形狀，也可以高能量形狀通過(guò)放出一個(gè)光子而變成低能量的形狀。這種與光子交換產(chǎn)生電子云形狀變化的術(shù)語(yǔ)叫作“能級(jí)躍遷”。一般當(dāng)電子云吸收一個(gè)短波長(zhǎng)的光子后會(huì)向高能量級(jí)躍遷，然后再變回基態(tài)給出一個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。所謂熒光就是原子云吸收一個(gè)短波長(zhǎng)光子（紫外光）之后再給出一個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)光子（藍(lán)黃紅等可見光）的過(guò)程。讓神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生不同顏色的熒光牽涉兩個(gè)關(guān)鍵問題，一是怎樣讓大分子產(chǎn)生不同顏色，二是怎樣讓基因攜帶這種大分子。

在發(fā)現(xiàn)熒光蛋白之前雖然人們已經(jīng)知道許多無(wú)機(jī)礦物和有機(jī)染料可以產(chǎn)生熒光，但是這些物質(zhì)都不能被基因攜帶進(jìn)大腦到發(fā)育過(guò)程。這是因?yàn)榛蛑荒軘y帶并讓細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)類的生物大分子。能產(chǎn)生熒光的蛋白在開始時(shí)并不是人可以設(shè)計(jì)出來(lái)的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分子是由一串氨基酸構(gòu)成，氨基酸鏈扭轉(zhuǎn)折疊形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，在能與光子作用的“生色基團(tuán)”附近如果有其他的分子，會(huì)在很大程度上影響熒光的亮度和顏色。所以，在熒光蛋白研究領(lǐng)域里的第一推動(dòng)來(lái)自于自然界的一個(gè)熒光蛋白。這第一個(gè)蛋白由日本科學(xué)家下村修（Osamu Shimomura）發(fā)現(xiàn)。

1958年，下村修在作碩士論文的時(shí)候發(fā)現(xiàn)水母中的一種蛋白在碰到水的時(shí)候會(huì)發(fā)出綠色的熒光。隨后下村修繼續(xù)此項(xiàng)研究并在1960 年代（他在普林斯頓大學(xué)做博士后）純化了水母中的綠色熒光蛋白（圖二）。

?圖二 從1960年代開始，下村(上圖后面站立的小伙子)在他的家人和朋友幫助下在太平洋沿岸采集可以在黑暗中發(fā)光的水母(中圖)，來(lái)源：諾獎(jiǎng)網(wǎng)站、ecoxotic.com。下圖：下村修用來(lái)切水母?jìng)泱w下緣的機(jī)器，由他當(dāng)時(shí)的老板Frank Johnson設(shè)計(jì)。

下村修發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白在1994年被哥倫比亞大學(xué)的查爾菲（Martin Chalfie）在其他物種中表達(dá)，由此證明這種蛋白可以脫離水母中的各種酶系統(tǒng)而獨(dú)立地發(fā)出熒光?？墒?，天然綠色熒光蛋白還不能作為一種有效的研究工具，因?yàn)樗姆肿訉?duì)環(huán)境敏感，而且發(fā)光的強(qiáng)度較弱且不穩(wěn)定。但是在這個(gè)天然的蛋白分子的啟發(fā)下，幾個(gè)研究小組開始利用分子生物學(xué)手段改變蛋白分子的氨基酸鏈以增加發(fā)光的效率。 1995年，Roger Tsien（錢永健，錢學(xué)森的堂侄，加州大學(xué)，圣迭戈）發(fā)現(xiàn)改變此蛋白分子上一個(gè)氨基酸后可以使其發(fā)光大大加強(qiáng)，并且十分穩(wěn)定。沿著這個(gè)思路在那幾年出現(xiàn)了一個(gè)“熒光蛋白熱”，幾個(gè)研究小組使用這種方法來(lái)改變天然的綠色熒光蛋白，使其不但更亮更穩(wěn)定，而且產(chǎn)生藍(lán)，黃，青等不同顏色。經(jīng)過(guò)十幾年不懈的努力，各種熒光蛋白終于加入了神經(jīng)科學(xué)家的功具箱。2008年，下村修，查爾菲和錢永健因?yàn)樵跓晒獾鞍追矫娴呢暙I(xiàn)分享了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)（圖三）。

說(shuō)起來(lái)改進(jìn)天然熒光蛋白的方法并不是靠研究者“拍腦袋”式的聰明設(shè)計(jì)，而是靠“大躍進(jìn)”式的隨機(jī)亂搞。這是因?yàn)槲覀儸F(xiàn)代的量子力學(xué)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以設(shè)計(jì)大分子的電子云。所以用隨機(jī)改變的方法反而顯得更聰明且高效。在改進(jìn)天然熒光蛋白的過(guò)程首先是把水母綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)接在細(xì)菌的DNA鏈上，然后讓細(xì)菌一變二，二變四地指數(shù)率增殖。每次細(xì)菌增殖時(shí)其整個(gè)DNA鏈都會(huì)復(fù)制自己，而復(fù)制都有可能出現(xiàn)錯(cuò)誤。這樣隨機(jī)產(chǎn)生的錯(cuò)誤也會(huì)出現(xiàn)在熒光蛋白的DNA代碼上，進(jìn)而在DNA翻譯成蛋白的時(shí)候氨基酸鏈也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的改變。這樣，在一個(gè)培養(yǎng)皿里種上幾個(gè)細(xì)菌，在合適的營(yíng)養(yǎng)和溫度之下細(xì)菌幾十分鐘就能繁殖一代。如此一夜時(shí)間就會(huì)繁殖幾十代，由一個(gè)細(xì)菌變成幾億個(gè)。在這幾億個(gè)細(xì)菌中攜帶的熒光蛋白中也會(huì)很多個(gè)隨機(jī)的突變。絕大多數(shù)突變是無(wú)意義的，即不會(huì)改變顏色或亮度。但是在上萬(wàn)個(gè)培養(yǎng)皿中，幾千億萬(wàn)億個(gè)突變事例里可能會(huì)出現(xiàn)個(gè)別有意義的突變，這樣研究者就能在紫外燈下看到一個(gè)亮點(diǎn)，或“萬(wàn)綠從中一點(diǎn)紅”這樣的顏色改變。由此可以把這個(gè)有意思的細(xì)菌揀出來(lái)，進(jìn)行下一步篩選。

?圖三 由于研究熒光蛋白工作獲得諾貝爾獎(jiǎng)的學(xué)者。左起：查爾菲、 下村修、錢永健。來(lái)源：圣迭戈大學(xué)

從這種研究方法上我們看到研究者利用了自然界進(jìn)化的“突變－選擇”的方法，只不過(guò)把自然界中需要多少萬(wàn)年發(fā)生的事加速到了幾年，在實(shí)驗(yàn)內(nèi)利用細(xì)菌快速繁殖傳代的特點(diǎn)達(dá)到目的。實(shí)際上水母也是靠進(jìn)化的辦法產(chǎn)生了綠色熒光蛋白，在黑暗的深海里造出了吸引魚類的小燈籠，從而帶來(lái)營(yíng)養(yǎng)以利自身的生存。

在1990年代我曾經(jīng)在美國(guó)東岸的伍茲霍海洋生物站（Woodshole Marine biological labs）工作過(guò)七個(gè)夏天。伍茲霍的夏天是神經(jīng)科學(xué)的圣地，在這個(gè)生物站開展的工作曾多次獲得諾貝爾獎(jiǎng)。在涼爽的夏夜，小鎮(zhèn)的飯館酒吧里坐滿神經(jīng)科學(xué)家，臉紅脖粗的爭(zhēng)論和高聲喧嘩的打賭聲中充滿了神經(jīng)科學(xué)的術(shù)語(yǔ)。在小路上我曾多次與下村修不期而遇，互相點(diǎn)頭致意。這是位樸實(shí)無(wú)華的退休老人是生物站的榮譽(yù)終生教授。我深深地記得他在做報(bào)告時(shí)會(huì)讓坐在門口的聽眾把屋里的燈全都關(guān)掉，在黑暗中他從口袋中摸出兩只試管，把兩種溶液混合在一起，產(chǎn)生幽幽鬼火似的藍(lán)光。在他得獎(jiǎng)前，年復(fù)一年，他不斷地重復(fù)著那六十年代的輝煌。我這樣的老聽眾也會(huì)和新來(lái)的學(xué)生一起，一遍又一遍地享受著那有趣的“祥林嫂故事”。錢永健的報(bào)告呢？當(dāng)然也聽過(guò)。屬于那種中氣十足，高潮迭起，每樣都能上Nature，Science那種頂級(jí)雜志的工作。在伍茲霍的夏天每周都有幾次當(dāng)紅大牛的報(bào)告，聽多了也會(huì)打瞌睡的。

熒光蛋白的諾貝爾獎(jiǎng)還有一個(gè)與其“擦肩而過(guò)”的悲崔故事。同在伍茲霍海洋生物站工作，首次克隆出綠色熒光蛋白的人不但沒有得到諾貝爾獎(jiǎng)，反而因生計(jì)所迫而離開了研究領(lǐng)域，變成了一個(gè)客車司機(jī)。他叫普拉舍（Douglas Prasher），1979年的博士，1983年到伍茲霍工作。據(jù)美國(guó)國(guó)家公共電臺(tái)（National public Radio, NPR）的采訪，1988年普拉舍得到美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的一筆基金，開始進(jìn)行克隆綠色熒光蛋白的工作。在今天看來(lái)，克隆天然的綠色熒光蛋白是此領(lǐng)域的一個(gè)必要的里程碑。他于1992年成功地完成了這個(gè)項(xiàng)目，并把克隆出的結(jié)果給了查爾菲，錢和其他幾百位科學(xué)家。可是，當(dāng)兩年后基金用完后他又去申請(qǐng)NIH（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所）的基金時(shí)被拒了。當(dāng)時(shí)普拉舍正在努力通過(guò)終身教授的程序，沒拿到NIH基金算是個(gè)硬傷，于是他不得不改行，轉(zhuǎn)到另一個(gè)研究機(jī)構(gòu)美國(guó)農(nóng)業(yè)部，搞一個(gè)不相干的動(dòng)植物檢疫工作。隨著美國(guó)研究資金的不斷削減，普拉舍幾年內(nèi)輾轉(zhuǎn)幾個(gè)技術(shù)工作，最后到了NASA（美國(guó)空間與太空總署）。然后由于NASA基金的裁減他就完全離開了科研領(lǐng)域，到當(dāng)?shù)匾粋€(gè)汽車行當(dāng)接送客人的司機(jī)。一個(gè)小時(shí)只掙8塊五（圖四）。

普拉舍的故事告訴我們不要成天抱怨自己的工作與諾貝爾獎(jiǎng)“擦肩而過(guò)”。就算是你做的就是諾爾獎(jiǎng)的里程碑式工作，也不見得就能申請(qǐng)到研究基金，就算得到基金，也不見得能得到終生教授，就算到了終生教授，也不見得還能得到基金繼續(xù)做科研。

?圖四 上圖：道格·普拉舍(Douglas Prasher)站在他的送客車前。后來(lái)他的故事廣為流傳，終得好人幫助，據(jù)說(shuō)現(xiàn)在已經(jīng)重回科研崗業(yè)。來(lái)源：nytimes.com。下圖：Prasher于1992年發(fā)表的“歷史上最悲壯的論文”。

五顏六色的熒光蛋白不但是研究大腦的有力工具，也逐漸進(jìn)入市場(chǎng)變成具有商業(yè)價(jià)值的商品。下圖所示的是一種轉(zhuǎn)有熒光蛋白基因的斑馬魚，可以在水族箱的紫外燈下發(fā)出各種顏色的美麗熒光。

?圖五 上圖，五顏六色的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。下：由錢實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的各色熒光蛋白(上圖來(lái)自：exotic-aquariums.com，下圖來(lái)自諾獎(jiǎng)官網(wǎng))

斑馬魚都可以五顏六色，那么把這種五顏六色放到腦子了是什么情況呢？這就是腦彩虹（brain bow） 技術(shù)，看清神經(jīng)細(xì)胞的一項(xiàng)美麗的技術(shù)，由哈佛醫(yī)學(xué)院的理奇曼（Jeff W. Lichtman） 和三思（ Joshua R. Sanes）小組于2007年發(fā)明。從圖一可以看到，利用此技術(shù)看到的神經(jīng)細(xì)胞每個(gè)的顏色都是獨(dú)一無(wú)二的。雖然很多細(xì)胞看起來(lái)都是紅的，但這個(gè)偏點(diǎn)黃，那個(gè)偏一點(diǎn)青，還有一個(gè)的偏一些紫。這樣通過(guò)計(jì)算機(jī)的顏色識(shí)別技術(shù)就能完全識(shí)別每個(gè)神經(jīng)細(xì)胞。追蹤他們的每個(gè)細(xì)小的分叉。哪怕他們緊密排列，分支互相交織纏繞。

腦彩虹技術(shù)的原理和彩色電視中的三原色技術(shù)類似。電視的顯示屏上雖然只有紅綠藍(lán)三種熒光粉，但通過(guò)調(diào)整每種熒光顏色的亮度，可以配比出萬(wàn)紫千紅的各種顏色。同樣，用腦彩虹技術(shù)可以讓紅綠黃藍(lán)青等幾種熒光蛋白出現(xiàn)在小鼠的每個(gè)腦細(xì)胞上。所謂熒光蛋白就是在紫外光下能發(fā)出彩色熒光的生物大分子。生物大分子的藍(lán)圖可以由基因攜帶。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓小鼠的神經(jīng)細(xì)胞攜帶熒光蛋白的基因，就能神經(jīng)細(xì)胞在熒光顯微鏡的紫外線照射下發(fā)出珣麗色彩。但怎樣讓每個(gè)不同的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出不同顏色的熒光呢？這就是腦彩虹技術(shù)的聰明之處。

我們知道動(dòng)物的整個(gè)身體是從一個(gè)受精卵發(fā)育而成的。在胚胎發(fā)育早期， 每個(gè)細(xì)胞都是全能的,就是所謂干細(xì)胞，每個(gè)都有潛能發(fā)育成身體上的不同器官。在胚胎發(fā)育時(shí)干細(xì)胞一變二，二變四，數(shù)量快速增加，胚胎的形狀也從一團(tuán)細(xì)胞變成一個(gè)管子。然后管子的背面出現(xiàn)一個(gè)皺褶，皺褶變成神經(jīng)管，出現(xiàn)一小群專一能發(fā)育成神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)管最后發(fā)育成脊髓，脊髓的前端膨大成大腦。追蹤神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)程中每一個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)和走向一直是神經(jīng)科學(xué)中的一個(gè)重要領(lǐng)域。 

理奇曼-三思小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的Cre-Lox recombination方法，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期讓每個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞都攜帶上很多套熒光蛋白的基因，在每套基因內(nèi)都含有紅黃藍(lán)三種熒光蛋白的編碼，并讓每套基因都有“重組”的機(jī)會(huì)。在重組的時(shí)候，可以把基因內(nèi)某個(gè)熒光蛋白的編碼刪掉。這樣，干細(xì)胞每次增殖時(shí)會(huì)出現(xiàn)一次重組，如果在重組時(shí)丟掉了一個(gè)藍(lán)色蛋白的密碼，細(xì)胞的熒光就會(huì)偏綠（紅黃色多些 ）。同樣，如果丟掉了一個(gè)紅色蛋白基因，細(xì)胞顏色就會(huì)偏向黃藍(lán)組合的青色。從神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育到成熟的大腦需要有多次干細(xì)胞增殖，每次增殖時(shí)細(xì)胞的顏色都會(huì)出現(xiàn)一些變化。干細(xì)胞每次增殖都會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)一模一樣的姊妹細(xì)胞，她們的基因一模一樣，顏色也是一樣的。而每個(gè)姊妹細(xì)胞的下一步增殖，顏色就會(huì)由于基因重組丟失不同的熒光蛋白而進(jìn)一步變化。最后達(dá)到每個(gè)成熟的神經(jīng)細(xì)胞都會(huì)攜帶一個(gè)獨(dú)特的紅黃藍(lán)熒光蛋白比例，形成圖一見到的美麗腦彩虹。 

這種用Cre-Lox方法產(chǎn)生基因隨機(jī)比例的方法見圖六，更詳細(xì)的解釋可以讀他們?cè)?007年發(fā)表于Nature的原始文獻(xiàn)。

?圖六  用Cre-Lox隨機(jī)重組技術(shù)產(chǎn)生隨機(jī)的顏色比例。 圖中上面的鏈條表示一段帶有紅，黃，藍(lán)三種熒光蛋白的基因，在熒光蛋白的基因之間有兩個(gè)lox開關(guān)（lox2272和loxP）。這個(gè)基因只能表達(dá)最左邊的熒光蛋白。因此在不出現(xiàn)重組時(shí)只表達(dá)紅色熒光蛋白（上面紅圈）。在出現(xiàn)cre-lox基因重組的時(shí)候可以甩掉兩個(gè)相同開關(guān)之間的一段DNA。這樣如果甩lox2272之間的一段（紅熒光蛋白）就會(huì)表達(dá)黃色熒光蛋白（中間黃圈）; 如果甩掉loxP之間的一段（紅，黃熒光蛋白）就只剩下藍(lán)色蛋白，（下面青圈）在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中有多個(gè)相同相同的DNA 片斷轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，每個(gè)都隨機(jī)地重組留下不同的片段，這樣每個(gè)細(xì)胞就會(huì)表達(dá)不同數(shù)量的熒光蛋白。（改畫自他們Nature文章的圖一A. )

腦彩虹技術(shù)只是人類認(rèn)識(shí)大腦過(guò)程中的一個(gè)美麗的故事。在神經(jīng)科學(xué)研究過(guò)程中，每一個(gè)里程碑之下都有多少美麗和悲傷的故事。但我寫一個(gè)小故事也需要一天甚至幾天，所以我每次動(dòng)筆前都很糾結(jié)應(yīng)該先寫哪個(gè)故事。

腦彩虹技術(shù)發(fā)明只有短短幾年，已經(jīng)有上千篇研究文章。其主要的用途之一是幫助科學(xué)家追蹤辨識(shí)胚胎中的神經(jīng)細(xì)胞，怎樣一路艱辛地發(fā)育成一個(gè)健康的大腦。在浩瀚的神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，這個(gè)技術(shù)只是利用光學(xué)方法研究大腦的一個(gè)事例?？戳诉@個(gè)故事讀者可能會(huì)問，既然能用熒光來(lái)看清糾纏在一起的神經(jīng)線路，那么我們能否用光學(xué)方法看到神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)？這就是錢永健教授的另一項(xiàng)重要貢獻(xiàn)，說(shuō)來(lái)話長(zhǎng)，只好且聽下回分解了。

本文原載《自然雜志》2014年第36卷第4期，標(biāo)題為：《美麗的腦彩虹》?！吨R(shí)分子》獲授權(quán)刊載，作者有修訂。