NgAgo或只能切割RNA，韓春雨論文不可重復(fù)性原因漸出水面
對于關(guān)心韓春雨NgAgo實驗的人來說，2017年1月底是一個重要的時間節(jié)點，因為《自然-生物技術(shù)》（下稱NBT）曾在去年11月28日發(fā)表聲明稱，將向論文作者提供機會，允許其在2017年1月底之前回應(yīng)質(zhì)疑、提供更多信息來支持自己的結(jié)論，屆時，NBT會向公眾公布論文作者的最新進展。然而，媒體誤讀了聲明，以為NBT將在1月底之前公布調(diào)查結(jié)論。事實上，最近NBT只是收到了新的數(shù)據(jù)，并未給出任何明確意見，該期刊將繼續(xù)開展可重復(fù)性調(diào)查。
但這并不妨礙NgAgo重新回到大眾視野。1月20日，美國冷泉港實驗室（CSHL）旗下的預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv發(fā)表了一篇來自韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究院基因組工程中心、科學(xué)技術(shù)聯(lián)合大學(xué)院和韓國國立首爾大學(xué)化學(xué)系Jin-Soo Kim課題組的題為“DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的文章。該文指出NgAgo介導(dǎo)的是DNA依賴的RNA切割，但目前沒有跡象能切割DNA。此前，韓春雨在NBT論文的賣點是對哺乳動物細胞基因組進行編輯，而基因編輯的前提條件是對DNA的切割，韓春雨等也在其圖1和圖3分別展示了NgAgo在體外和體內(nèi)切割DNA的結(jié)果。顯然，韓國研究組也無法重復(fù)其對DNA的體外切割實驗。如果韓國課題組該結(jié)果被業(yè)界廣泛重復(fù)和驗證，則將從根本上否定韓春雨論文報道的用NgAgo作為DNA編輯工具的可能性。
值得一提的是，韓國課題組此番發(fā)表的這個DNA依賴性的RNA剪切并非新發(fā)現(xiàn)，比如早在十幾年前，美國洛克菲勒大學(xué)的Tomas Tushcl實驗室與Dinshaw J. Patel實驗室就已經(jīng)對此有所報道。
——《賽先生》
下文來自微信公眾號“BioArt”，經(jīng)授權(quán)轉(zhuǎn)載。
1月20日，美國冷泉港實驗室（CSHL）旗下的預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv發(fā)表了一篇來自韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究院基因組工程中心、科學(xué)技術(shù)聯(lián)合大學(xué)院和韓國國立首爾大學(xué)化學(xué)系Jin-Soo Kim課題組的題為“DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的文章，該文指出NgAgo介導(dǎo)的DNA依賴的RNA切割是有效的。
值得注意的是，該文的通訊作者Jin-Soo Kim正是2016年11月28日領(lǐng)銜在Nature Biotechnology雜志發(fā)表題為“Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”的correspondence類型的文章，直指 NgAgo 不能夠進行基因編輯。Jin-Soo Kim一直是基因編輯領(lǐng)域的大腕，在NBT和其他一流雜志上曾發(fā)表過多篇關(guān)于基因編輯的重要文章。
Jin-Soo Kim課題組在預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv發(fā)表的文章在摘要中清晰地指出，NgAgo能夠作為一種DNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶靶向性切割RNA而不是DNA（下圖）。作者證實了NgAgo能在體外與5’ 羥基化或者磷酸化的單鏈DNA組合，將RNA切割成兩個或多個片段。
NgAgo在gODN的作用下能夠特異性的切割對應(yīng)基因的RNA轉(zhuǎn)錄本，顯然并不作用于單鏈DNA（ssDNA）或者雙鏈DNA（dsDNA）（下圖）。
上述結(jié)果很好地解釋了為什么此前許多實驗室都能夠做出韓春雨去年5月2號發(fā)表在NBT中的Figure 3圖，既降低外源GFP的表達。這也解釋了去年11月11日Cell Research以Letter to Editor形式在線發(fā)表的來自南通大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)研究人員合作完成的題為“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的論文中發(fā)現(xiàn) gDNA/NgAgo 系統(tǒng)在斑馬魚中能實現(xiàn)特定基因敲低導(dǎo)致魚眼部發(fā)育缺陷，但是不能對靶基因進行基因編輯。此外，更早以前北大魏文勝實驗室運用 gDNA/NgAgo 系統(tǒng)也能看到目的基因的表達下調(diào)但不能實現(xiàn)DNA編輯。韓國科學(xué)家的這項研究可能為gDNA/NgAgo 系統(tǒng)的基因編輯引發(fā)的系列爭議給出了比較好的解釋和實驗證據(jù)，看來gDNA/NgAgo 系統(tǒng)確實能在體外很好的實現(xiàn)RNA的編輯（下圖）。
關(guān)于在8月8日，韓春雨向質(zhì)粒共享信息庫 Addgene 提交新版的詳細實驗方法，其中特別提到了轉(zhuǎn)染中應(yīng)避免EDTA對鎂離子的鰲合問題（Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells into the plates for transfection，引自韓春雨向Addgene提交的新版實驗方法）。在預(yù)印本的這篇文章中專門設(shè)計了實驗證明在體外實驗中，在有EDTA的情況下，NgAgo確實不能切割RNA（下圖）。
比較好玩的一點是，NgAgo 能重復(fù)使用，反復(fù)切割。相比之下一個 Cas9 分子只能使用一次（下圖）。
作者在文章最后的討論部分提到，NgAgo系統(tǒng)可以用來作為生物醫(yī)學(xué)研究的一種RNAi工具來介導(dǎo)特異性的mRNA或者lncRNAs的降解。
要點：該課題組可能為了搶速度，直接把論文公布在預(yù)印本網(wǎng)站上而不是走同行評議渠道發(fā)表在正式的期刊上，關(guān)鍵一點是上述實驗都是在體外進行的，所以后續(xù)還需要進一步在體內(nèi)進行驗證。鑒于課題面臨的競爭，想必還有其他課題組也在完成類似的工作。讓我們拭目以待吧！
通訊作者Jin-Soo Kim：
韓國先進技術(shù)研究所基因編輯研究中心主任
Jin-Soo Kim is an entrepreneur and chemist-turned-biologist. He graduated from Seoul National University in 1987 with a major in chemistry. He then earned a master’s degree in chemistry from Seoul National University in 1989 and a Ph.D. in biochemistry from the University of Wisconsin-Madison in 1994. After postdoctoral training at Howard Hughes Medical Institute/Massachusetts Institute of Technology, he came back to Seoul in 1997 to serve as Principal Investigator at Samsung Biomedical Research Institute. He co-founded a biotechnology company, ToolGen, Inc., focused on zinc finger technology in 1999, and served as CEO and CSO for the subsequent 6 years. He joined the faculty of the Department of Chemistry at Seoul National University in 2005. He now serves as Director of Center for Genome Engineering at Institute for Basic Science. He has published over 60 articles and filed 20 patent applications, mostly in the field of gene regulation and genome editing. He has been a member of Faculty of 1000 since May, 2013.
（致謝：夏迪、蔣威二位博士對本文有重要貢獻！）
① 《自然-生物技術(shù)》發(fā)文否定韓春雨基因編輯工作，明年1月完成調(diào)查
③ 多國科學(xué)家宣布：迄今未能重復(fù)韓春雨NgAgo實驗結(jié)果
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