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?課題總體設(shè)計(jì)

目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為探究細(xì)胞類群多樣性的常用技術(shù)手段，而不同的測(cè)序技術(shù)在細(xì)胞捕獲和基因捕獲效率上具有各自不同的優(yōu)勢(shì)。例如，目前常用的10x Genomics測(cè)序技術(shù)利用基于微滴包被的原理，可實(shí)現(xiàn)一次實(shí)驗(yàn)獲得較多的細(xì)胞數(shù)量，有效降低了單細(xì)胞測(cè)序的實(shí)驗(yàn)成本；而SMART-seq2測(cè)序技術(shù)則利用孔板對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通量相對(duì)較低，但每個(gè)細(xì)胞的基因捕獲率相對(duì)較高。因此，本研究結(jié)合了SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’兩種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，并整合這兩種平臺(tái)的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，充分發(fā)揮不同數(shù)據(jù)類型的優(yōu)勢(shì)，獲得高分辨率的肝癌免疫圖譜。

癌旁組織和外周血是腫瘤相關(guān)研究中常用的對(duì)照組織，而其他相關(guān)的免疫器官或病理組織則較少受到關(guān)注。例如，腹水是肝癌患者常見的病理現(xiàn)象，其產(chǎn)生與肝癌預(yù)后不良有關(guān)，然而腹水中的免疫細(xì)胞組成及其與肝癌的聯(lián)系尚不清楚。因此，本研究收集肝癌病人的癌組織、癌旁組織、淋巴結(jié)、外周血和腹水五種組織的CD45+免疫細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并分析肝癌免疫微環(huán)境中的細(xì)胞類型、表達(dá)特征，以及不同組織之間細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化與聯(lián)系。

1. 不同組織的免疫組成有較大差異，腫瘤中的巨噬細(xì)胞構(gòu)成腹水中髓系細(xì)胞的主要來(lái)源

整合兩種單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，研究人員刻畫了高分辨率的肝癌免疫圖譜，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和髓系細(xì)胞等主要細(xì)胞類群以及主要類群下屬的40類細(xì)胞亞群。這些細(xì)胞亞群在不同組織中呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞類型富集特征，其中腹水中的細(xì)胞類型呈現(xiàn)明顯的特異性。

為探究腹水中細(xì)胞的潛在起源，研究者將腹水中的免疫細(xì)胞與其他組織中的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)腹水中的淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞來(lái)源明顯不同，淋巴細(xì)胞與外周血細(xì)胞有明顯的相似性，而髓系細(xì)胞主要定位于腫瘤組織細(xì)胞。隨后，通過(guò)前沿的生物信息學(xué)分析方法RNA velocity和基于線粒體突變的進(jìn)化樹構(gòu)建，研究者對(duì)巨噬細(xì)胞從腫瘤到腹水的遷移過(guò)程進(jìn)行了確認(rèn)。

2. 腫瘤中的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的狀態(tài)(TAM-like和MDSC-like)

通過(guò)與其他數(shù)據(jù)中的巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組對(duì)應(yīng)，研究者發(fā)現(xiàn)肝癌腫瘤中的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的狀態(tài)：TAM-like和MDSC-like狀態(tài)。生存分析表明，前者的特征基因與預(yù)后不良有關(guān)，其表達(dá)的兩個(gè)關(guān)鍵基因SLC40A1和GPNMB也與預(yù)后不良有關(guān)。通過(guò)CRISPR技術(shù)在THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起重要作用。

3. 腫瘤中的LAMP3+ DC是成熟態(tài)的DC，具有向肝淋巴結(jié)遷移和與多種淋巴細(xì)胞相互作用的潛在能力

腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細(xì)胞，傳統(tǒng)上分為cDC1和cDC2，而本研究鑒定出一群特點(diǎn)突出的DC，即LAMP3+ DC。這群DC與cDC1和cDC2在表達(dá)特征上有較大的差別，主要表達(dá)CD80, CD83, CCR7等與成熟和細(xì)胞遷移有關(guān)的基因。而且這一類樹突狀細(xì)胞不僅存在于肝癌中，也存在于乳腺癌和肺癌中。

隨后，研究者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LAMP3+ DC是成熟態(tài)的DC，且具有較高的遷移能力。通過(guò)前沿的生物信息學(xué)分析方法RNA velocity和基于線粒體突變的進(jìn)化樹構(gòu)建，研究者發(fā)現(xiàn)LAMP3+ DC可能同時(shí)起源于cDC1和cDC2，且具有向肝淋巴結(jié)遷移的潛在能力。

?左圖：將肝癌組織中樹突狀細(xì)胞的RNA velocity的計(jì)算結(jié)果投射到在Diffusion Map坐標(biāo)上，顏色代表不同的細(xì)胞群。

右圖：基于線粒體基因突變構(gòu)建的LAMP3+ DC進(jìn)化樹。

腫瘤浸潤(rùn)性的LAMP3+ DC發(fā)揮了廣泛調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的作用，它們與T細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)的配體-受體相互作用數(shù)量最多。LAMP3+ DC通過(guò)CCL19-CCR7和CCL22-CCR4吸引T細(xì)胞，并通過(guò)CD86-CD28作用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群，通過(guò)CD86-CTLA4作用于耗竭性T細(xì)胞亞群。研究者通過(guò)多色免疫組化對(duì)表達(dá)PD-1的T細(xì)胞與表達(dá)PD-L1的LAMP3+ DC進(jìn)行了空間位置的判斷，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)出相鄰的位置，為其相互作用提供了另一角度的證據(jù)。然而，LAMP3+ DC在腫瘤中的作用與功能仍需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

本項(xiàng)研究首次對(duì)肝癌臨床樣本進(jìn)行包括病理組織在內(nèi)的多組織位點(diǎn)的收集，并利用前沿的生物信息學(xué)分析方法，通過(guò)自體對(duì)照，不僅描述了肝癌微環(huán)境的免疫組分和狀態(tài)，而且描繪了腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞跨組織的動(dòng)態(tài)過(guò)程。此項(xiàng)國(guó)際領(lǐng)先的開創(chuàng)性工作，可為人們研究肝癌和其他疾病中的免疫細(xì)胞，以及開發(fā)新的臨床檢測(cè)與治療方案提供新的思路。例如，論文的共同第一作者何堯指出，聯(lián)合使用具有不同優(yōu)勢(shì)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞異質(zhì)性的研究或可成為相關(guān)研究的范式策略之一。

研究揭示了腫瘤中的巨噬細(xì)胞構(gòu)成腹水中髓系細(xì)胞的主要來(lái)源。由于外周血的免疫特征與腫瘤中具有較大差異，而組織活檢的取樣難度相對(duì)較大，該結(jié)果為利用肝癌病人的腹水代替外周血或活檢組織進(jìn)行腫瘤狀態(tài)檢測(cè)提供了新的思路。針對(duì)巨噬細(xì)胞中與較差預(yù)后相關(guān)的基因GPNMB和SLC40A1，研究者通過(guò)揭示其在巨噬細(xì)胞中的炎癥作用，為相關(guān)藥物治療提供了潛在靶點(diǎn)。而研究發(fā)現(xiàn)的LAMP3+樹突狀細(xì)胞，可從腫瘤遷移到周淋巴結(jié)，表達(dá)多種免疫配體基因，并具有與多種T淋巴細(xì)胞類型相互作用的潛力。這為后續(xù)進(jìn)一步對(duì)該細(xì)胞類型進(jìn)行研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，提出了通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境進(jìn)行腫瘤治療的可能性，并為基于樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞療法提供了新的思路和依據(jù)。