挑戰(zhàn)生命基本公式：人工合成實(shí)現(xiàn)大腸桿菌全基因組重編碼
放大10000倍的大腸桿菌圖 ，Photo by Eric Erbe, digital colorization by Christopher Pooley。 來(lái)源：Wikipedia
撰文 | 黃宇翔
責(zé)編 | 陳曉雪
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長(zhǎng)久以來(lái)，合成生物學(xué)家都懷有一個(gè)夢(mèng)想：希望能有一天合成出完整的人類(lèi)基因組。然而，這項(xiàng)工作的難度就好比要求你用四種顏色的小小玻璃珠，沿著北京市五環(huán)路按照指定的次序串上五圈，中間還不允許出錯(cuò)！
理想還是要有的。最近，英國(guó) MRC 實(shí)驗(yàn)室研究員 Jason Chin 領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)取得了階段性的勝利：他們成功為大腸桿菌（Escherichia coli）的完整基因組重編寫(xiě)了遺傳密碼子 [1]。如果沿用上面的比喻，大致相當(dāng)于用玻璃珠準(zhǔn)確、不間斷地圍著一個(gè)400米的操場(chǎng)完整串了一圈。
通訊作者Jason Chin照片
來(lái)源：MRC網(wǎng)站（https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/jason-chin-awarded-the-2019-sackler-prize/）
“這是一個(gè)里程碑式的工作?！?哈佛大學(xué)教授 George Church 在接受美國(guó)媒體 STAT 采訪(fǎng)時(shí)評(píng)論說(shuō)。
全基因組水平最大規(guī)模的密碼子重編寫(xiě)
從大腸桿菌到哺乳動(dòng)物細(xì)胞都遵守中心法則：DNA 經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄生成 mRNA，mRNA 經(jīng)過(guò)翻譯形成蛋白質(zhì)。在翻譯的過(guò)程中，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，對(duì)應(yīng)一種氨基酸或者是終止信號(hào)。由于細(xì)胞存在64種密碼子，而參與翻譯的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸只有20種，其中存在著冗余性，因此研究者設(shè)想可以通過(guò)密碼子同義替換，在基因組中刪除特定的密碼子，進(jìn)而可以將空閑出的密碼子用于編碼非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。
在這項(xiàng)研究中，Jason Chin 團(tuán)隊(duì)通過(guò)人工合成、替換的方式，將大腸桿菌全基因組的64個(gè)密碼子成功縮減為61個(gè)，是目前全基因組水平上最大規(guī)模的密碼子重編寫(xiě)工作。
該研究通過(guò)同義替換將大腸桿菌基因組的64個(gè)遺傳密碼子縮減為61個(gè)。 來(lái)源：Fredens et al,. Nature,2019
研究者將大腸桿菌約 4Mb 的基因組劃分為8個(gè)小節(jié)，每個(gè)小節(jié)再細(xì)分為長(zhǎng)度 100kb 左右的4-5個(gè)的模塊。通過(guò)體外 DNA 合成構(gòu)建出一條條長(zhǎng)度約10kb的片段，再借助酵母細(xì)胞的同源重組，研究者將十條左右的片段拼接為包含了長(zhǎng)約100kb模塊的細(xì)菌人工染色體（Bacterial Artificial Chromosome, BAC）。
然后，基于此前 Jason Chin 開(kāi)發(fā)的 REXER 技術(shù) [2]，研究者將 BAC 電轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞，再利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)將大腸桿菌基因組中的~100kb長(zhǎng)的同源序列替換為人工合成的序列模塊。Jason Chin 設(shè)計(jì)的 BAC 在同源模塊兩端具有特殊的選擇標(biāo)記，因此能夠在大腸桿菌中可迭代地進(jìn)行 REXER，每一輪循環(huán)替換約100kb基因組，最終實(shí)現(xiàn)將大腸桿菌的整個(gè)基因組都替換為人工合成的同源序列的目標(biāo)。
研究者在人工合成的基因組中將編碼絲氨酸的密碼子 TCG、TCA 分別替換為同義的 AGC、AGT，將終止密碼子 TAG 全部替換為 TAA。在大腸桿菌 MDS42 株系中，以上三種替換所涉及變更的密碼子總計(jì)達(dá)18218個(gè)，新合成的株系被命名為 Syn61，用來(lái)紀(jì)念這個(gè)只含有61個(gè)密碼子的全新生命體。盡管在全基因組范圍內(nèi)，檢測(cè)到8個(gè)非預(yù)期突變，但研究者認(rèn)為這些突變對(duì)于相關(guān)基因的表達(dá)沒(méi)有影響。
該研究構(gòu)建的Syn61大腸桿菌基因組圖譜 來(lái)源：Fredens et al,. Nature, 2019
在2011年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院合成生物學(xué)家 George Church 成功將大腸桿菌的基因組中全部314個(gè)琥珀終止密碼子（amber stop codon，TAG）替換為同義的 TAA 終止密碼子。該研究是第一個(gè)在全基因組范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)密碼子重編寫(xiě)的工作，但是其所主要使用的 MAGE 技術(shù)，是基于設(shè)計(jì)寡聚核苷酸鏈進(jìn)行多位點(diǎn)同步替換的原理，僅僅可以對(duì)所要編輯的個(gè)別位點(diǎn)進(jìn)行替換。George Church 的這項(xiàng)工作事實(shí)上并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌全基因組的完全合成。同時(shí)，該工作所采用的基因編輯策略的固有特性限制了進(jìn)一步擴(kuò)大重編寫(xiě)遺傳密碼子規(guī)模的可能性。[3]
2016年，George Church 又報(bào)道了將大腸桿菌密碼子由64個(gè)密碼子壓縮為57個(gè)密碼子的嘗試，提出了先將4Mb的基因組拆分成87個(gè)約50kb大小的片段并單獨(dú)構(gòu)造了片段替換的菌株，再整合到同一個(gè)基因組中的設(shè)想。[4]
“未來(lái)對(duì)全基因組遺傳密碼子的重編碼將會(huì)成為遺傳工程領(lǐng)域的一項(xiàng)巨大的飛躍，一旦實(shí)現(xiàn)，將意味著合成生物學(xué)從基礎(chǔ)科學(xué)向產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化的序幕正式被拉開(kāi)?！?在談到在整個(gè)基因組范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)編碼氨基酸的遺傳密碼子同義壓縮的可能性時(shí)，哈佛大學(xué)教授 Don Ingber 在2013年表示 [5]。
今天， Chin 團(tuán)隊(duì)正式實(shí)現(xiàn)了六年前 Don Ingber 所暢想的這項(xiàng)壯舉。
此項(xiàng)研究具有怎樣的意義？
“密碼子的重編寫(xiě)挑戰(zhàn)了生命的基本公式，” 帝國(guó)理工學(xué)院的合成生物學(xué)家 Tom Ellis 在接受STAT 采訪(fǎng)時(shí)說(shuō)，“你將可以利用自然提供給我們的原材料做一些完全不同的事情?！?Tom Ellis 解釋說(shuō)，通過(guò)重編寫(xiě)遺傳密碼子，人們將有可能在體內(nèi)合成含有非經(jīng)典氨基酸的新蛋白，這種新蛋白未來(lái)在臨床上具有潛在的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
Church 在接受 STAT 采訪(fǎng)時(shí)則表示，Syn61 可能具有對(duì)病毒感染更好的抵抗性，假如應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)，有可能為生物制藥產(chǎn)業(yè)節(jié)省下由于病毒感染所導(dǎo)致的每年上百萬(wàn)美元的經(jīng)濟(jì)損失。[6]
“密碼子同義壓縮的細(xì)菌未來(lái)將可以合成非經(jīng)典的生物聚合物，這具有生產(chǎn)新型材料和醫(yī)藥的潛力。” 該研究通訊作者 Jason Chin 告訴《知識(shí)分子》。
近些年來(lái)，合成生物學(xué)發(fā)展迅速，其安全性也一直備受關(guān)注，由于遺傳密碼子被重編寫(xiě)的大腸桿菌可能對(duì)病毒產(chǎn)生抗性，因此一旦從實(shí)驗(yàn)室環(huán)境泄露到外界，可能會(huì)超出人力所能控制的范圍。[7]
“Syn61菌株相比于野生型大腸桿菌生長(zhǎng)速率較慢，預(yù)計(jì)在實(shí)驗(yàn)室外競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)其他細(xì)菌?！?Chin 介紹說(shuō)。他同時(shí)表示，“ 隨著合成生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，有必要進(jìn)行廣泛的討論，以確保有合適的保護(hù)措施?！?nbsp;
參考文獻(xiàn)：
[1] Julius Fredens et al., (2019) Total synthesis of Escherichia coli with arecoded genome. Nature. DOI: 10.1038/s41586-019-1192-5
[2] Kaihang Wang et al., (2016) Defining synonymous codon compression schemes bygenome recoding. Nature. DOI: 10.1038/nature20124
[3] Isaacs,F.J et al., (2011) Precise manipulation of chromosomes in vivo enablesgenome-wide codon replacement. Science. DOI: 10.1126/science.1205822
[4] OstrovN et al., (2016) Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome.Science. DOI: 10.1126/science.aaf3639
[5] https://wyss.harvard.edu/radical-recoding/
[6] https://www.statnews.com/2019/05/15/recoded-bacteria-genome-made-from-scratch/
[7] John Bohannon, (2016) Biologists areclose to reinventing the genetic code of life. Science. DOI: 10.1126/science.aah7205
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