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新藥申請(qǐng)被暫停，基因編輯療法走向臨床還有哪些挑戰(zhàn)？

2022/11/11
導(dǎo)讀
11.10
知識(shí)分子
The Intellectual

基因編輯療法仍需克服重重挑戰(zhàn) | 圖源：istockphoto.com,rommma


 導(dǎo)  讀

基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9在2012年的橫空出世，使得人類(lèi)通過(guò)基因編輯手段治愈遺傳疾病的夢(mèng)想更近了，也帶動(dòng)了基因編輯療法開(kāi)發(fā)和投資的空前繁榮。目前，已有一些公司將體外基因編輯治療管線推進(jìn)到了臨床試驗(yàn)階段，而大多數(shù)企業(yè)的管線尚處于臨床前研發(fā)階段或新藥臨床試驗(yàn)申報(bào)階段。
然而，具體到被寄予厚望、更具挑戰(zhàn)的體內(nèi)基因編輯療法，距離臨床應(yīng)用仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。在這篇文章中，基因編輯技術(shù)從業(yè)者吳奇詳細(xì)介紹了基因編輯療法的發(fā)展，當(dāng)前的產(chǎn)業(yè)格局以及體內(nèi)基因編輯療法亟待跨越的三座大山。
撰文 | 吳奇
責(zé)編 | 陳曉雪


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2022年11月7日，美國(guó)生物醫(yī)藥公司 Verve Therapeutics 發(fā)表聲明，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已暫停其基因編輯療法Verve-101的臨床試驗(yàn)研究新藥（IND）申請(qǐng)。


Verve-101是一款用于治療雜合子家族性高膽固醇血癥的藥物，今年7月在新西蘭完成首例患者給藥，是全球首個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的體內(nèi)堿基編輯療法。而堿基編輯技術(shù)，由美國(guó)哈佛大學(xué)劉如謙團(tuán)隊(duì)發(fā)明，被認(rèn)為是下一代基因編輯技術(shù)，具有安全性好、編輯更加精準(zhǔn)的特點(diǎn)。


目前還不清楚FDA為何暫停Verve-101的IND申請(qǐng)。隨著CRISPR-Cas9和堿基編輯等基因編輯技術(shù)的發(fā)明，基因編輯領(lǐng)域迎來(lái)研發(fā)和投資的熱潮，但體內(nèi)基因編輯療法目前尚未有任何產(chǎn)品獲批上市，走向?qū)嶋H應(yīng)用挑戰(zhàn)重重。要真正發(fā)揮體內(nèi)基因編輯的作用，我們還需要在基因編輯工具、脫靶風(fēng)險(xiǎn)控制和遞送效率等方面的大量基礎(chǔ)研究工作支持。



基因突變帶來(lái)了人類(lèi)的性狀多樣性
也可能導(dǎo)致疾病
近30年測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，讓我們認(rèn)識(shí)到雖然人與人之間的基因同源度非常高，但仍然存在非常少量的基因差異，有些差異基因遺傳自我們的祖先，有些則可能是偶發(fā)產(chǎn)生的基因突變。這些差異讓我們擁有不同顏色的頭發(fā)、皮膚與虹膜等等。在演化上，這些基因差異使我們能更快速的適應(yīng)多變的環(huán)境，但有時(shí)也會(huì)帶來(lái)適應(yīng)性缺陷或遺傳性疾病。


由于基因序列上的突變、缺失、插入、重組等現(xiàn)象導(dǎo)致的罕見(jiàn)遺傳病，全球目前已發(fā)現(xiàn)有數(shù)千種，覆蓋人數(shù)超過(guò)3億。每一種罕見(jiàn)遺傳病的發(fā)現(xiàn)，及其致病過(guò)程與遺傳特征的鑒定，都凝聚了無(wú)數(shù)患者及家屬的血與淚，以及幾代科研與醫(yī)學(xué)工作者的大膽探索和辛勤付出。但是，超過(guò)90%的罕見(jiàn)遺傳病仍缺乏有效的治療手段。


以腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥（Adrenoleukodystrophy，ALD）為例，這是一種X染色體隱性伴性遺傳病。由于ABCD1基因的缺陷，導(dǎo)致體內(nèi)超長(zhǎng)鏈脂肪酸異常積累，破壞髓鞘和腦神經(jīng)系統(tǒng)?；颊叨酁槟行裕l(fā)病年齡中位數(shù)為7歲。發(fā)病后患者會(huì)逐漸出現(xiàn)神經(jīng)退行性病變，失去說(shuō)話行動(dòng)，吞咽甚至呼吸的能力，從發(fā)病到死亡往往僅有幾年的生存期。


1992年，美國(guó)拍了一部電影《羅倫佐的油》（Lorenzo's Oil），講述了關(guān)于ALD的一個(gè)真實(shí)故事。奧登夫婦的孩子洛倫佐，罹患了罕見(jiàn)的ALD。當(dāng)時(shí)針對(duì)ALD并沒(méi)有任何有效的治療手段，僅能通過(guò) “低脂飲食” 來(lái)盡可能控制超長(zhǎng)鏈脂肪酸的積累。夫妻兩人為了救自己的孩子，自學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)，希望能找到一種治療的手段。經(jīng)過(guò)數(shù)年的努力，他們發(fā)現(xiàn)通過(guò)攝入一種特殊的混合脂肪酸，可以顯著降低洛倫佐體內(nèi)的超長(zhǎng)鏈脂肪酸水平，能夠顯著減緩ALD的病情惡化。他們將研究出的這種油命名為“洛倫佐的油”。在他們的呵護(hù)下，洛倫佐的預(yù)期壽命被延長(zhǎng)了至少20年。


遺憾的是，洛倫佐的油只能延緩疾病的惡化，并不能從根本上治愈疾病。與之類(lèi)似的許多其他遺傳病的現(xiàn)存療法也存在類(lèi)似的問(wèn)題。


例如，血友病同樣是一種X染色體伴性遺傳的隱性遺傳病，發(fā)病者主要為男性?；颊呋蚪M內(nèi)的凝血因子編碼基因缺陷導(dǎo)致體內(nèi)缺乏凝血因子蛋白。歷史上著名的英國(guó)維多利亞女王就是血友病基因的隱性攜帶者。因歐洲王室之間的通婚，使血友病基因傳播到了各國(guó)王室，致出現(xiàn)了多位“脆弱”王子。血友病同樣是無(wú)法被完全治愈。僅可以通過(guò)定期通過(guò)靜脈注射獲取重組凝血因子蛋白的方式來(lái)緩解癥狀。


因此，從發(fā)現(xiàn)這些疾病大多來(lái)源于我們自身基因組DNA上的缺陷那天起，就誕生了一種從根本上治愈罕見(jiàn)遺傳病的大膽方案：


既然基因出現(xiàn)了缺陷，那最直接的治療思路就是：給他一個(gè)正確的基因。


美國(guó)藍(lán)鳥(niǎo)生物公司（Bluebird Bio）最近獲批的基因療法，就是一種基因增補(bǔ)療法。


2022年8月和9月， FDA先后批準(zhǔn)了藍(lán)鳥(niǎo)生物治療β-地中海貧血癥（β-thalassemia）和腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥（ALD）的兩款基因療法。這兩款療法的定價(jià)分別為280萬(wàn)美元和300萬(wàn)美元。


針對(duì)腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥，藍(lán)鳥(niǎo)生物的基因療法（Skysona）是將正確的ABCD1基因裝載于慢病毒載體中，再轉(zhuǎn)導(dǎo)到患者自體的造血干細(xì)胞里，這些細(xì)胞就具有了能合成正常ALD蛋白的功能，即恢復(fù)了對(duì)超長(zhǎng)鏈脂肪酸的代謝能力。然后再將這些造血干細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，即可達(dá)到治療的目的。


類(lèi)似地，血友病也可通過(guò)這樣策略進(jìn)行治療。目前一種可行的方案，就是通過(guò)腺相關(guān)病毒（AAV）作為載體來(lái)攜帶凝血因子基因進(jìn)入患者體內(nèi)，提供相比于定期靜脈注射重組凝血因子更持久的治療效果。


然而，通過(guò)病毒載體遞送功能基因的基因增補(bǔ)療法并不完美。


例如，慢病毒載體本身存在向基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)，這種整合是隨機(jī)的，錯(cuò)誤整合導(dǎo)致抑癌基因被破壞，就可能會(huì)有癌變的風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)然在這類(lèi)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)回輸療法中會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行全面的質(zhì)控，但風(fēng)險(xiǎn)依舊不能排除。另外，即便轉(zhuǎn)導(dǎo)成功，病毒載體也會(huì)隨著時(shí)間緩慢降解。近期有研究發(fā)現(xiàn)，單劑量AAV注射后經(jīng)過(guò)數(shù)年后，凝血因子的產(chǎn)量會(huì)降低到剛接受治療后的10%左右 [1]。而基于AAV病毒載體往往無(wú)法進(jìn)行二次注射，因?yàn)槭状巫⑸鋾r(shí)大劑量注入的病毒顆粒會(huì)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫記憶，二次注射時(shí)大部分的病毒顆粒就會(huì)被抗體中和。還有一個(gè)問(wèn)題是，病毒載體的生產(chǎn)成本非常高，一般單人單劑量所需的AAV的生產(chǎn)成本往往就高達(dá)數(shù)十萬(wàn)美元，因此基于病毒載體的基因療法成了迄今為止最貴的藥物，這使得無(wú)論是患者個(gè)人還是醫(yī)療保障體系都無(wú)法輕松承擔(dān)。這也是藍(lán)鳥(niǎo)生物最新獲批的兩款基因療法定價(jià)昂貴的重要原因之一。


而從完全治愈遺傳病的角度來(lái)看，基因增補(bǔ)療法可以在一段時(shí)間內(nèi)使患者的癥狀減緩，甚至消失，但因?yàn)檫@種療法并沒(méi)有改變我們自體細(xì)胞的基因組序列，病變的基因依舊存在，隨著患者體內(nèi)病毒載體的降解，病癥仍有較大可能重新出現(xiàn)。因此，科學(xué)家們期待能從我們自身的基因組下手，改變導(dǎo)致這些遺傳疾病的基因。



揭開(kāi)基因編輯的秘密
上世紀(jì)70-80年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了基因的同源重組 (homology directed repair, HDR)現(xiàn)象。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，序列高度一致的兩段DNA，會(huì)在特定的細(xì)胞生理狀態(tài)下（例如細(xì)胞分裂前期）出現(xiàn)極低頻率的DNA序列交換。如果我們可以人為引入一段DNA序列到細(xì)胞里，而這段DNA序列包含有一段位于中間的目的功能基因序列和分布在兩端的同源臂序列（與想替換的靶基因兩端序列高度一致），那么就有一定的概率將細(xì)胞中的病變基因替換成我們?nèi)藶橐氲恼_基因，實(shí)現(xiàn)修補(bǔ)基因缺陷的目的。


不過(guò)，這樣的效率往往低得可憐，通常小于十萬(wàn)分之一，顯然沒(méi)辦法用來(lái)做基因治療。后來(lái)，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)如果我們能在病變的靶基因中間給它剌上一刀，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂，就能顯著提升同源重組現(xiàn)象發(fā)生的效率，使其達(dá)到百分之幾甚至幾十，這使得修復(fù)基因組中的基因缺陷成為可能。


但新問(wèn)題又出現(xiàn)了：怎樣才能在基因組DNA上的特定位置剌上一刀呢？


科學(xué)家希望找到一種可編程的分子剪刀。它需要滿足兩個(gè)最重要的特征：

1，能夠被靈活設(shè)計(jì)來(lái)匹配不同的靶DNA序列，即具有可編程性；
2，能夠在識(shí)別位點(diǎn)的附近切割DNA產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，即具有核酸酶活性。


在2012年之前，已存在有鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator like effector nuclease, TALEN）這兩種可編程分子剪刀。它們都是通過(guò)串聯(lián)一系列具有DNA識(shí)別功能的蛋白質(zhì)模塊來(lái)特異性識(shí)別一段人為設(shè)計(jì)的靶DNA序列，再通過(guò)融合的核酸酶來(lái)切割DNA。


然而，這兩種工具缺點(diǎn)也十分明顯。首先蛋白識(shí)別DNA的特異性并不是100%一一對(duì)應(yīng)的。出現(xiàn)兼容性識(shí)別到其他的DNA序列上的概率并不低，并且這種脫靶的DNA結(jié)合往往難以預(yù)測(cè)。另外，每設(shè)計(jì)構(gòu)建靶向于某一位點(diǎn)的分子剪刀，就需要按識(shí)別的DNA順序來(lái)組裝這個(gè)分子剪刀的編碼基因序列。想識(shí)別9個(gè)堿基對(duì)的DNA就需要串聯(lián)組裝3個(gè)鋅指蛋白編碼基因，或串聯(lián)組裝9個(gè)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子編碼基因。這說(shuō)起來(lái)簡(jiǎn)單，但在分子生物技術(shù)上，一次性連接多個(gè)DNA片段事實(shí)上還是非常具有挑戰(zhàn)性的。門(mén)檻高、成本高的問(wèn)題，使基因編輯技術(shù)在很長(zhǎng)一段時(shí)間里一直被高懸于象牙塔的最頂端。


直到2012年，法國(guó)微生物學(xué)家埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和美國(guó)生化學(xué)家詹妮弗·杜德納（Jennifer A. Doudna）系統(tǒng)性解析了來(lái)源于釀膿鏈球菌中獲得性免疫系統(tǒng)——CRISPR-Cas9系統(tǒng)的分子機(jī)制，使基因編輯變得更加簡(jiǎn)單和高效，也使許多疾病的基因療法稱為可能。CRISPR-Cas9系統(tǒng)與之前的兩種分子剪刀大不相同，識(shí)別不再依靠串聯(lián)的蛋白模塊，而是依靠Cas9蛋白介導(dǎo)一段引導(dǎo)RNA序列與靶DNA序列之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)完全匹配時(shí)，Cas9的核酸酶功能就會(huì)被激活，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂 [2]。


之后，以卡彭蒂耶和杜德納為創(chuàng)始人的基因編輯公司 Intellia therapeutics，開(kāi)發(fā)了針對(duì)一種名為 “轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性”（Transthyretin amyloidosis, ATTR）的罕見(jiàn)遺傳病的基因編輯療法，并在2021年8月在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（NEJM）公開(kāi)了首批臨床試驗(yàn)的結(jié)果 [3]。


轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）是一種由肝臟為主導(dǎo)合成的甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，正常情況下會(huì)形成同源四聚體結(jié)構(gòu)。但當(dāng)它的編碼基因出現(xiàn)幾種特定的突變時(shí)，這種蛋白就會(huì)錯(cuò)誤地聚集成淀粉樣纖維，集中分布于患者的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管和生殖系統(tǒng)中，形成多種類(lèi)型的病征，并顯著降低患者的預(yù)期壽命。轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性疾病目前全球約有5萬(wàn)左右的患者，在非裔美國(guó)人中相對(duì)盛行。這種疾病具有漸進(jìn)性，即沒(méi)有人為干預(yù)就會(huì)一直惡化下去。


目前干預(yù)該病的療法主要有兩類(lèi)，一類(lèi)是轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白四聚體穩(wěn)定劑，例如tafamidis，可減緩?fù)蛔兊鞍椎牡矸蹣幼冃浴Ａ硪活?lèi)是基因沉默藥物，例如Patisiran，它的本質(zhì)是一種小干擾RNA（siRNA），通過(guò)脂質(zhì)納米顆粒（Lipid nanoparticle, LNP）將siRNA遞送至肝臟細(xì)胞中，siRNA能夠抑制突變蛋白的合成。只是，患者需要定期且長(zhǎng)期攝入藥物，卻無(wú)法做到完全的治愈。


CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，使治愈出現(xiàn)了可能。前期的研究發(fā)現(xiàn)完全失活TTR編碼基因并不會(huì)對(duì)人體的正常生理功能產(chǎn)生影響。那么，想要治愈它，只需要將肝臟細(xì)胞中突變的TTR基因完全破壞即可。


這里就要提到真核細(xì)胞中的另一種DNA修復(fù)機(jī)制，即非同源末端重組（NHEJ），這種機(jī)制時(shí)時(shí)刻刻都在監(jiān)控細(xì)胞核里的基因組DNA序列是否出現(xiàn)了雙鏈DNA斷裂。一旦出現(xiàn)了雙鏈DNA斷裂，NHEJ相關(guān)蛋白就會(huì)快速響應(yīng)保護(hù)斷裂的DNA末端，并快速將斷裂的DNA再重新連起來(lái)。這一機(jī)制事關(guān)細(xì)胞的生死，如果雙鏈DNA斷裂不能及時(shí)修復(fù)，或同時(shí)細(xì)胞中出現(xiàn)大量的雙鏈DNA斷裂，都可能直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但這種快速響應(yīng)修復(fù)機(jī)制卻存在缺陷，重連的DNA往往會(huì)出現(xiàn)一點(diǎn)小錯(cuò)誤，一般會(huì)缺幾個(gè)堿基對(duì)或多幾個(gè)堿基對(duì)。因此，如果我們利用CRISPR-Cas9基因編輯器，在目標(biāo)基因的蛋白編碼序列上引入一個(gè)雙鏈DNA斷裂。接下來(lái)細(xì)胞自己的NHEJ修復(fù)機(jī)制發(fā)揮作用，幾個(gè)堿基的缺失或插入，就足以完全破壞一個(gè)編碼基因的三聯(lián)體讀碼框，最終失活基因的功能。


Intellia設(shè)計(jì)的治療方案，就利用了非同源末端重組的機(jī)制。經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的引導(dǎo)sgRNA與編碼Cas9核酸酶的mRNA，分別包裝在表面嵌有膽固醇分子的LNP中。靜脈注射后，LNP在載脂蛋白的幫助下會(huì)主要進(jìn)入肝臟并與肝臟細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，將引導(dǎo)sgRNA與編碼Cas9核酸酶的mRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。在細(xì)胞自身的翻譯機(jī)器的幫助下，Cas9核酸酶得以合成，并與sgRNA結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，在突變的TTR基因上引入雙鏈DNA斷裂。細(xì)胞的NHEJ機(jī)制在修復(fù)雙鏈DNA斷裂過(guò)程中，就會(huì)破壞失活突變的TTR基因。從公開(kāi)的治療數(shù)據(jù)來(lái)看，經(jīng)過(guò)單次注射（3.0 mg/kg）一個(gè)月后，患者的血清中的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白水平就降低到治療前10%左右的水平。


對(duì)于不同類(lèi)型的遺傳病，往往需要根據(jù)病變基因的特征設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的個(gè)性化治療方案。例如，大多數(shù)的遺傳疾病都是因?yàn)榛蛑械膯魏塑账岫鄳B(tài)性（即單點(diǎn)突變）導(dǎo)致的，但突變的類(lèi)型卻多種多樣，不僅如此，相同或相似的病征背后的遺傳因素也存在多樣性（即相同或不同基因上的存在不同突變）。還有一些遺傳病是因?yàn)椴糠只蚱蔚膭h除、異常重復(fù)、或重排等等。


相對(duì)來(lái)說(shuō)，ATTR的基因編輯治療方案是比較簡(jiǎn)單的，即①基因編輯器打斷突變基因，②細(xì)胞NHEJ修復(fù)過(guò)程失活突變基因。但想要實(shí)現(xiàn)對(duì)特定類(lèi)型基因突變的精確修復(fù)，僅使用“分子剪刀”來(lái)打斷突變基因是不夠的，因?yàn)榧?xì)胞的NHEJ修復(fù)途徑并不會(huì)完全按我們想要的方式來(lái)修復(fù)打斷的突變基因。另外，人體內(nèi)大多數(shù)的細(xì)胞也并非都處于分裂活躍期，因此想通過(guò)引入修復(fù)模板和細(xì)胞的同源重組途徑來(lái)精準(zhǔn)修復(fù)打斷的突變基因也幾乎不可能。


近年來(lái)，以哈佛大學(xué)劉如謙教授團(tuán)隊(duì)為主導(dǎo)，先后開(kāi)發(fā)了基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)且不依賴于細(xì)胞修復(fù)途徑的兩類(lèi)基因編輯器——堿基編輯器與先導(dǎo)編輯器 [4-6]。它們都可以不打斷或不完全打斷基因的前提下修復(fù)基因突變，使得基因編輯更加精準(zhǔn)。這些新型基因編輯工具的出現(xiàn)，為開(kāi)發(fā)新型基因編輯療法提供了更多可能。目前，劉如謙作為創(chuàng)始人的BEAM Therapeutics和Prime Medicine兩家公司正在分別嘗試將這兩項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于遺傳病的基因編輯療法中。


但體內(nèi)基因編輯作為新興療法，走向應(yīng)用的過(guò)程注定充滿了各種挑戰(zhàn)。



基因編輯產(chǎn)業(yè)格局：群雄逐鹿
以CRISPR-Cas9系統(tǒng)為代表的多種基因編輯技術(shù)的橫空出世，帶來(lái)了基因編輯產(chǎn)業(yè)的空前繁榮。


目前國(guó)內(nèi)外已成立有數(shù)十家基因編輯公司，大多公司的創(chuàng)始人都來(lái)自于研發(fā)基因編輯相關(guān)技術(shù)的大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。整體來(lái)看，這一行業(yè)還處于群雄逐鹿的發(fā)展早期。這些公司大體可分為兩種類(lèi)型，一類(lèi)專注于研發(fā)基因編輯工具，以對(duì)外專利授權(quán)和合作研發(fā)為主要業(yè)務(wù)。另一類(lèi)也是最多的一類(lèi)，將現(xiàn)有的基因編輯工具，例如CRISPR-Cas9等轉(zhuǎn)化開(kāi)發(fā)為針對(duì)特定疾病的基因編輯療法，它們的主要業(yè)務(wù)與開(kāi)發(fā)小分子藥物的邏輯基本類(lèi)似，開(kāi)發(fā)的基因編輯療法被視作一種特殊的藥物，同樣需要經(jīng)歷臨床前研究階段（靶點(diǎn)功能驗(yàn)證、動(dòng)物試驗(yàn)、藥理毒理評(píng)估、安全性評(píng)估、生產(chǎn)工藝質(zhì)量和穩(wěn)定性研究等）；臨床試驗(yàn)審批；1期2期3期臨床試驗(yàn)；新藥上市審批；上市后研究；上市后再審批等步驟。


當(dāng)然，基因編輯療法相比于小分子藥物開(kāi)發(fā)具有諸多方面的優(yōu)勢(shì)。首先，基因編輯療法目前多是開(kāi)發(fā)針對(duì)罕見(jiàn)遺傳病（孤兒病）的療法，因此在新藥臨床試驗(yàn)審批等過(guò)程中往往更加快速。另外，基因編輯的靶點(diǎn)通常是DNA。DNA作為靶點(diǎn)通常更加簡(jiǎn)單。而小分子藥物的靶點(diǎn)通常是蛋白質(zhì)，在靶點(diǎn)驗(yàn)證階段需要花費(fèi)的時(shí)間更長(zhǎng)。小分子藥物的研發(fā)周期多在8-10年以上，而基因編輯療法的周期相對(duì)短一些。


只是，基因編輯療法還太年輕，目前僅有國(guó)外Intellia Therapuetics、Editas medicine、CRISPR Therapuetics、國(guó)內(nèi)的博雅輯因等幾家公司，將基因編輯治療管線推進(jìn)到了臨床試驗(yàn)階段。大多數(shù)公司的管線都尚處于臨床前研發(fā)階段或新藥臨床試驗(yàn)申報(bào)階段。  


其中走的較快的管線，都不約而同的選擇了地中海貧血癥和鐮刀型貧血癥的基因編輯治療。這是因?yàn)檫@兩種疾病都是走體外編輯細(xì)胞再回輸體內(nèi)的技術(shù)路線，即分離患者的造血干細(xì)胞，在體外進(jìn)行基因編輯后，再回輸至患者體內(nèi)。體外編輯基因的難度比體內(nèi)低很多，相對(duì)來(lái)說(shuō)不需要挑剔基因編輯工具的尺寸，可選擇的基因編輯方法更加多樣化、不挑剔遞送載體和方式。而且對(duì)編輯效率要求相對(duì)不高（可分離出成功編輯的細(xì)胞），脫靶問(wèn)題也相對(duì)更加可控、易于評(píng)估。在以上兩種疾病之外，利用基因編輯技術(shù)改造T細(xì)胞和NK細(xì)胞再回輸給患者的CAR-T和CAR-NK技術(shù)也十分熱門(mén)。而體內(nèi)基因編輯治療管線的推進(jìn)則相對(duì)來(lái)說(shuō)會(huì)緩慢一些。



體內(nèi)基因編輯療法的三座“大山”
目前限制體內(nèi)基因編輯療法發(fā)展的主要有三大方面，分別是基因編輯工具的限制，脫靶的風(fēng)險(xiǎn)和遞送的效率。


基因編輯工具箱是基因編輯領(lǐng)域內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)最激烈的地方，可編程核酸酶、脫氨酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等都是其中影響基因編輯成敗的重要工具。年初剛剛落下帷幕的美國(guó)CRISPR-Cas9專利之爭(zhēng)就是最好的證明。經(jīng)過(guò)10年的研究與探索，可用于基因編輯的CRISPR-Cas系列核酸酶已有數(shù)十種之多。除了Cas9家族之外，還有Cas12家族核酸酶可用于編輯DNA。除此之外的Cas13家族可用于編輯RNA。但大多數(shù)此領(lǐng)域的專利歸屬權(quán)都在美國(guó)的幾家單位（哈佛大學(xué)博德研究所、加州大學(xué)系統(tǒng)等），而基因編輯相關(guān)技術(shù)已被列入了技術(shù)進(jìn)出口管制清單。Cas9專利產(chǎn)生爭(zhēng)議之后，各單位對(duì)專利保護(hù)范圍的限定都十分細(xì)致。而且，由于美國(guó)專利法的保護(hù)范圍往往十分寬泛，這使得后來(lái)者原創(chuàng)發(fā)現(xiàn)保護(hù)新的基因編輯工具更加困難，往往只能獲得有限的專利保護(hù)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)的數(shù)家研究機(jī)構(gòu)，例如中科院神經(jīng)科學(xué)研究所、中科院動(dòng)物研究所、上?？萍即髮W(xué)、華東師范大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)等，在新型基因編輯工具開(kāi)發(fā)領(lǐng)域內(nèi)也取得了令人矚目的進(jìn)展和突破。


脫靶是評(píng)估基因編輯器性能和基因編輯療法安全性的重要指標(biāo)。如果雙鏈DNA斷裂出現(xiàn)在本不該出現(xiàn)的地方，特別是抑癌基因中間并導(dǎo)致其失活，則存在誘發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。在開(kāi)發(fā)基因編輯療法的過(guò)程中，盡管研究者會(huì)提前進(jìn)行多個(gè)維度的離體細(xì)胞中脫靶現(xiàn)象評(píng)估，但仍無(wú)法排除體內(nèi)編輯時(shí)出現(xiàn)脫靶編輯的可能。目前有許多研究者致力于改善CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脫靶現(xiàn)象，并開(kāi)發(fā)了諸多經(jīng)過(guò)改造的Cas9核酸酶變體，例如xCas9, SpRY, Cas9-HF1等等；或發(fā)現(xiàn)了其他新型Cas核酸酶，如Cas12家族核酸酶被不斷擴(kuò)充，已被證實(shí)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯的類(lèi)型就有Cas12a(又名Cpf1）, Cas12b(又名c2C2）, Cas12e (又名CasX)， Cas12f (又名Cas14)，Cas12i，Cas12j (又名CasΦ)等。目前較多研究結(jié)果認(rèn)為，Cas12家族核酸酶的保真性是高于Cas9的（但核酸酶活性往往弱于Cas9）。


在脫靶問(wèn)題上，一般認(rèn)為在細(xì)胞中核酸酶活性越高，脫靶出現(xiàn)的可能性就越高。在優(yōu)化Cas9保真性的過(guò)程中，有時(shí)脫靶率的降低也伴隨著核酸酶活性的顯著降低，脫靶有時(shí)只是降低到了某種脫靶檢測(cè)方法的檢出限之下。而不同的脫靶檢測(cè)方法之間也存在很大的區(qū)別。例如，體外脫靶檢測(cè)方法（Digenome-seq，Circle-seq等）中，多使用分離純化的人細(xì)胞基因組DNA在體外進(jìn)行切割試驗(yàn)，然后進(jìn)行全基因組測(cè)序或局部捕獲測(cè)序來(lái)鑒定脫靶切割位點(diǎn)，但這類(lèi)體外方法往往存在較多噪音，其鑒定的許多位點(diǎn)無(wú)法在細(xì)胞體系中驗(yàn)證。而基于離體細(xì)胞的檢測(cè)方法（例如Guide-seq, PEM-seq）等，大多需要利用特殊的細(xì)胞內(nèi)DNA重組事件，例如外源提供的短雙鏈DNA的插入或雙鏈DNA斷裂導(dǎo)致的染色體重排等，這些方法鑒定出的脫靶位點(diǎn)雖然較容易被重復(fù)驗(yàn)證，但檢測(cè)靈敏度卻相對(duì)受限。并且以上的這些檢測(cè)方法大都依賴高通量測(cè)序技術(shù)，最終數(shù)據(jù)分析過(guò)程中閾值的劃定也顯著影響著對(duì)脫靶事件的判定。目前脫靶檢測(cè)尚缺乏一種較為通用且公認(rèn)的方法。


另外，具體到堿基編輯器，其剛剛問(wèn)世時(shí)，科學(xué)界普遍認(rèn)為不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂的堿基編輯器應(yīng)該會(huì)更精準(zhǔn)更安全。在精準(zhǔn)方面相比打斷DNA的方式，堿基編輯器確實(shí)可以做到不打斷DNA就能實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的改變。但事實(shí)上，堿基編輯時(shí)若編輯窗口內(nèi)存在多個(gè)底物堿基，則均可能會(huì)被編輯或同時(shí)被編輯，縮小編輯窗口可以更加精準(zhǔn)，這卻縮小了堿基編輯器可編輯的范圍。在安全性方面，目前已證實(shí)可實(shí)現(xiàn)的C->T堿基編輯的CBE（cytosine base editor）的安全性欠佳，因?yàn)榘奏っ摪泵甘且环N針對(duì)單鏈DNA的脫氨酶，而細(xì)胞在多種生理過(guò)程中都會(huì)暫時(shí)性出現(xiàn)單鏈DNA，胞嘧啶脫氨酶就可能在這時(shí)發(fā)生脫靶編輯。而實(shí)現(xiàn)A->G堿基編輯的ABE（adenosine base editor）的安全性則相對(duì)較好。


有了好的基因編輯工具和方法，還需要把它們高效送到特定的細(xì)胞或組織器官中才能發(fā)揮功能。目前的主流遞送工具有LNP脂質(zhì)納米顆粒、AAV腺相關(guān)病毒、 LV慢病毒、 VLP類(lèi)病毒顆粒等。


在新冠疫情之后，mRNA疫苗能快速推廣得益于LNP遞送技術(shù)。而LNP技術(shù)同樣可以用來(lái)遞送基因編輯工具。其優(yōu)點(diǎn)是：相對(duì)廉價(jià)、制備簡(jiǎn)單、不挑剔遞送物的分子類(lèi)型和尺寸。本文開(kāi)頭提到的Verve Therapeutics公司暫停IND的基因編輯療法，即是通過(guò)LNP遞送技術(shù)，利用堿基編輯技術(shù)抑制肝臟中 PCSK9 基因的表達(dá)，從而降低低密度脂蛋白膽固醇，實(shí)現(xiàn)對(duì)包括雜合子家族性高膽固醇血癥在內(nèi)的心血管疾病的預(yù)防和治療。但是，目前LNP僅能實(shí)現(xiàn)比較高效肝、肺等器官的定向遞送，相對(duì)缺乏遞送靈活性。


AAV是一種目前公認(rèn)安全的病毒載體，組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，經(jīng)人工改造后可以不包含病毒基因元件。而且，AAV目前發(fā)現(xiàn)的血清型眾多，具有比LNP更好的組織器官特異性，例如在眼睛、耳朵等特殊器官的遞送方面。但AAV的最大限制是其承載能力十分有限，極限承載容量約為4700 nt的單鏈DNA。例如分子尺寸較大的Cas9和Cas12a類(lèi)型核酸酶，以及基于它們開(kāi)發(fā)的堿基編輯器，都很難通過(guò)AAV進(jìn)行遞送。目前有諸多研究團(tuán)隊(duì)致力于開(kāi)發(fā)具有更小分子尺寸的基因編輯工具。AAV的另一個(gè)問(wèn)題就是生產(chǎn)成本居高不下。使用AAV向大器官遞送基因的成本，可能高達(dá)每劑數(shù)十萬(wàn)美元。AAV還存在一個(gè)問(wèn)題就是人體免疫，大部分人在一生中都感染過(guò)腺病毒或腺相關(guān)病毒，就可能已經(jīng)存在抗體，這可能削弱遞送的效果。而且，正如前文所說(shuō)，患者在經(jīng)過(guò)一次AAV治療后，抗體的水平會(huì)顯著提高，使得二次治療幾乎不可能。另外，雖然AAV本身是安全的，無(wú)DNA重組風(fēng)險(xiǎn)，但如果使用AAV攜帶基因編輯器進(jìn)入細(xì)胞，遞送的基因編輯器將可能存在數(shù)年之久，這無(wú)異于是在細(xì)胞里放了一顆不定時(shí)炸彈，或許在體外的脫靶檢測(cè)中數(shù)天到數(shù)周的周期里無(wú)法檢測(cè)到脫靶編輯，但數(shù)年的時(shí)間很難說(shuō)是否會(huì)有可能產(chǎn)生不可預(yù)期的脫靶。


在細(xì)胞生物學(xué)中已廣泛應(yīng)用的另一種高效的基因遞送工具是慢病毒LV。這是一種有缺陷的HIV病毒，本身就存在向基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)。目前國(guó)外已有基于LV開(kāi)發(fā)的基因治療管線因?yàn)長(zhǎng)V的安全問(wèn)題而停止研發(fā)了。近期基于LV研發(fā)的VLP，則解決了安全性的問(wèn)題。VLP中不再包含LV的遺傳物質(zhì)，僅利用了病毒的外殼，將需要遞送的蛋白或核酸分子包裝在內(nèi)部。


結(jié)  語(yǔ)


基因療法目前雖然多關(guān)注于罕見(jiàn)遺傳病，但在未來(lái)解決了諸多限制因素后，必然也會(huì)拓展至常見(jiàn)病的領(lǐng)域。而由于基因療法能從源頭上治愈疾病，因此可以預(yù)見(jiàn)基因療法將是未來(lái)我們戰(zhàn)勝疾病、延長(zhǎng)壽命、提升生活質(zhì)量的必然選擇。
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1. Samelson-Jones, B.J. & George, L.A. Adeno-associated Virus Gene Therapy for Hemophilia. Annu. Rev. Med. (2022).

2. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).

3. Gillmore, J.D. et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N. Engl. J. Med. 385, 493-502 (2021).

4. Anzalone, A.V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019).

5. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).

6. Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).




制版編輯 | 姜絲鴨


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