成年人的大腦里面還有沒有神經(jīng)干細胞存在？| 圖源：pixabay.com

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成年人的大腦里面還有沒有神經(jīng)干細胞存在，這些神經(jīng)干細胞是否還能繼續(xù)生成新的神經(jīng)元？過去10多年，業(yè)內(nèi)人普遍認為，存在；然而，近幾年的一些研究卻認為，不存在。

一般來說，證明存在，比較簡單；證明不存在，可能工作量就比較大，需要更嚴格的鑒定標準，經(jīng)得起統(tǒng)計學(xué)方面的考驗。

無論如何，當(dāng)神經(jīng)發(fā)育結(jié)束后，成熟的人類大腦一共有大約800億神經(jīng)元和800億神經(jīng)膠質(zhì)細胞，要在所有這些細胞中尋找神經(jīng)干細胞，是很有挑戰(zhàn)的。

撰文｜錢誠   周峰泉（約翰霍普金斯大學(xué)）

責(zé)編｜邸利會

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成年人大腦中是否有神經(jīng)干細胞，科學(xué)家關(guān)注這個問題，有兩個簡單的理由。

首先，如果成年人的大腦中還存在著神經(jīng)干細胞，并且能夠通過某種方法刺激這些神經(jīng)干細胞分裂增殖，并重新分化為神經(jīng)元，可能是一種非常有效的治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的新療法。

神經(jīng)元受到損傷或疾病侵擾后會死亡。許多神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥，帕金森綜合癥等疾病，主要病理后果是神經(jīng)元的死亡。神經(jīng)元的死亡是導(dǎo)致認知功能下降的主要原因。

因為神經(jīng)元無法重新分裂產(chǎn)生新的神經(jīng)元，目前針對人類大腦損傷或者神經(jīng)退行性疾病，基本缺少有效的治療方法。

另外，過去大概20年，許多實驗室研究了成年小鼠大腦中神經(jīng)干細胞的功能。

他們發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠大腦中的海馬區(qū)部位有不少的神經(jīng)干細胞。這些成年神經(jīng)干細胞與神經(jīng)發(fā)育期間的神經(jīng)干細胞相似，可以繼續(xù)分裂，產(chǎn)生更多的神經(jīng)干細胞，同時也可以分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，且分化后的神經(jīng)元可以整合到已經(jīng)形成的神經(jīng)環(huán)路中發(fā)揮功能。

另外，其他一系列研究表明，如果對小鼠進行運動或智力訓(xùn)練，小鼠的許多高級認知功能，如學(xué)習(xí)和記憶能力，就會有明顯增加。

大家一致認為，小鼠大腦中的海馬區(qū)域是負責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，進一步的研究表明，在海馬區(qū)域的神經(jīng)干細胞對小鼠認知功能的提高起著非常重要的作用。

基于這些研究結(jié)果，大家認為，成年動物大腦中存在的神經(jīng)干細胞及其產(chǎn)生新生神經(jīng)元的能力，也是大腦神經(jīng)可塑性的一個重要組成部分。

由此推斷，如果成年人的大腦中也存在類似的神經(jīng)干細胞，也可以通過運動或者智力訓(xùn)練來增加自己的認知能力，或者說變得更加聰明。

人類大腦的樣品主要有兩個來源, 最常見的是由死者家屬捐獻的大腦組織。另外，部分患有腦部疾病的病人在治療過程中需要做部分腦組織切除手術(shù)，切除出來的大腦組織，經(jīng)病人及其家屬同意，也是樣品的另一個主要來源。

由于樣品來源的特殊性，對樣品進行任何預(yù)處理的可能性雖然有，但是很低?？偨Y(jié)下來，目前大概有以下幾種方法尋找并鑒定人類大腦神經(jīng)干細胞。

一是，直接尋找神經(jīng)干細胞。

成年的神經(jīng)干細胞與胚胎發(fā)育期間的神經(jīng)干細胞基本類似（包括特異性蛋白，所處腦區(qū)，和轉(zhuǎn)錄組特征等）。神經(jīng)干細胞可以分裂，且含有一些在神經(jīng)干細胞中相對特異表達的蛋白質(zhì)（標志蛋白）。

其次，可以尋找由神經(jīng)干細胞分化而產(chǎn)生的新神經(jīng)元。與原有的老的神經(jīng)元相比，這些新生成的神經(jīng)元也表達一些相對特異的標志蛋白。

第三種是首先通過標記物來標記所有正在分裂的細胞（如Brdu, Bromodeoxyuridine, 中文名是溴脫氧腺苷。它是DNA中脫氧胸苷的類似物，可以在細胞分裂時參入新和成的DNA中，常用于檢測分裂的活細胞），然后過一段時間再尋找含有這些標記物、同時也表達神經(jīng)元特異性蛋白的細胞。這類細胞就是由神經(jīng)干細胞分化而產(chǎn)生的神經(jīng)元。

以上三種方法主要是通過抗體染色實驗完成的。

最后，通過對大腦特定區(qū)域的細胞進行單細胞測序，可以得到每個細胞樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。通過對該數(shù)據(jù)庫進行生物信息分析，可以幫助我們鑒定具有神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)錄組的細胞。

雖然實驗手段經(jīng)歷了幾個技術(shù)世代—— 從組織切片原位免疫染色為主、分散細胞染色后通過流式儀計數(shù)，到整批細胞混在一起核酸測序（bulk tissue RNA-seq），再到單細胞（核）RNA測序（見下表）—— 關(guān)于成年人大腦海馬區(qū)神經(jīng)干細胞究竟存在與否，以及有無內(nèi)源成年神經(jīng)生發(fā)，至今尚沒有共識見解。

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科學(xué)技術(shù)總有瑕疵，但伴隨更多數(shù)據(jù)不斷產(chǎn)生，以及多種不同技術(shù)的相互輔證（比如FISH RNAscope（RNA原位雜交技術(shù)）和multiplex免疫染色（多試幾種抗體）聯(lián)合），技術(shù)層面的障礙會越來越小。

如果采用染色的策略，那每一個細胞染出來了就捕獲了那個細胞，剩下的就是通過什么標準去給每個細胞身份賦值定性為神經(jīng)干細胞。

定錯了，無非制造兩個結(jié)果，不是假陽性，就是假陰性。如果不考慮抗體質(zhì)量糟糕結(jié)合了靶目標之外的其它蛋白這種技術(shù)障礙，剩下的問題就是——

除了經(jīng)典的細胞標志蛋白染色技術(shù)，我們認為通過新技術(shù)單細胞測序研究細胞身份應(yīng)該是一個更準確的方法。

那么，單細胞（核）測序能不能捕獲上面通過染色實驗（見上表）發(fā)現(xiàn)的那些成年人腦神經(jīng)干細胞（若有）？

理論上應(yīng)該沒問題。

染色實驗是通過抗體直接檢測蛋白質(zhì)，而核酸測序是檢測編碼蛋白的信使RNA。目前默認設(shè)置的常規(guī)測序深度通常能在每個細胞（核）平均測到3、4千個表達基因，當(dāng)然增加開銷可以測得更深。染色實驗一般最多染3、4個蛋白，而且通常這些蛋白標志物表達量不會太低，所以編碼它們的RNA應(yīng)該能被單細胞（核）測序抓到。

如果只關(guān)心3、4個基因表達，那么細胞（核）的測序，從某種角度上看就相當(dāng)于針對20萬細胞樣品通過檢測3、4個細胞標志物來鑒定神經(jīng)干細胞（此外，除了鑒定細胞類型，單細胞測序結(jié)果通過大數(shù)據(jù)分析也可以推斷細胞分裂的情況，能分裂也是干細胞的特點之一）。

那么具體如何通過單細胞（核）mRNA測序鑒定細胞類型？

首先，利用每個細胞平均測到的3、4千個表達基因的轉(zhuǎn)錄組為依據(jù)，我們可以在相對高數(shù)量的維度上通過大數(shù)據(jù)分析將彼此相似的細胞歸并為一類，就是聚類分析。

在捕獲細胞（核）數(shù)量足夠，測序深度良好的情況下，每類細胞還可以再細分成一些亞型。雖然所用軟件或計算方法可能不同，聚類分析本身是一個基于關(guān)聯(lián)性的無偏過程。

但對于分出來的每個類別（cluster）的細胞身份認定最終還是人定的，并且這是個極度依賴先驗知識的步驟。

具體來說，通過數(shù)據(jù)分析可以算出每個cluster表達明顯高的50到100個基因，再根據(jù)這些基因里有什么已知細胞類型的幾個標志物來決定這個cluster的身份，最后可以再結(jié)合FISH或者抗體染色去復(fù)證。

當(dāng)然這50到100個基因中還有希望發(fā)現(xiàn)新穎的，更純的細胞身份標志物。同理，單細胞測序后的聚類分析也可以重新驗證某些傳統(tǒng)的細胞身份標志物是否確實不在其它細胞類型中表達（細胞特異性）。比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 就發(fā)現(xiàn)在成年人腦海馬區(qū)中，常用的新生神經(jīng)元標志蛋白Dcx不僅僅是未成熟新生神經(jīng)元的標志。

由于人類大腦樣品來源不易，大多數(shù)情況下只能在單一時間點取樣，而不像動物模型那樣可以獲得幾個時間點real-time的樣品。但是即使在單一時間點，同一組織內(nèi)每個細胞的狀態(tài)也略有差別。換一句說，在一群細胞中會存在處于某個生物過程中不同階段的細胞亞群。

現(xiàn)有的大數(shù)據(jù)分析技術(shù)可以通過一個稱為Pseudo-time trajectory的分析方法從單一時間點取樣的單細胞（核）測序數(shù)據(jù)中，找到這些細胞亞群，從而模擬整個生物過程。

比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 就發(fā)現(xiàn)通過分析成年小鼠，豬，恒河猴的單細胞測序結(jié)果，可以描繪一條從Neural intermediate progenitor cells（神經(jīng)干細胞），到新生神經(jīng)元，再到成熟神經(jīng)元 （granule cell）的一個神經(jīng)細胞分化成長的過程。然而在同樣條件下，研究者們在成年人類大腦海馬區(qū)就測不到這個細胞過程?；诖私Y(jié)果，該研究認為在這些人類大腦樣品中不存在神經(jīng)干細胞。

2021年發(fā)表在Neuron 雜志這兩篇單細胞核測序文章 [1,2] 均聚焦探尋成年人腦海馬區(qū)的神經(jīng)干細胞和新生神經(jīng)元。結(jié)果簡言之，都沒找到。

在成年人海馬腦區(qū)齒狀回區(qū)域探尋神經(jīng)干細胞和神經(jīng)生發(fā)過程，是因為早先實驗在成年哺乳動物，比如嚙齒目中的小鼠，非人靈長類，以及幼年人類海馬區(qū)齒狀回發(fā)現(xiàn)了顯著的新生神經(jīng)元蹤跡，或者至少存在神經(jīng)元生發(fā)過程。

至于成年人大腦中神經(jīng) “干細胞”，如果存在，目前大家普遍認為它們存在的區(qū)域和其它特性與其它動物模型中和幼年人類腦中發(fā)現(xiàn)的干細胞類似。這一先入為主的觀點是否正確或限制了我們的視野，因為沒有先驗依據(jù)，暫時無法回答，但值得關(guān)注。

單細胞（核）mRNA測序也不是完美無瑕的，通常缺點恰恰出自優(yōu)點。

單細胞測序同樣依賴先驗知識來給細胞身份賦值定性。分析的時候選定幾個參數(shù)之后，聚類是可以由計算機自動計算完成的。但是把每個cluster認定成什么細胞類型、亞型、狀態(tài)，仍然是需要人為依照先驗標志去賦值。

打個比方，如果蒙上眼睛去摸比如20萬只動物，每個有3、4千特征值（甚至多些達到上萬個特征），就可以把比如大象分成一堆，長頸鹿，綿羊，貓狗，禽類，魚類各自成堆，分析的細一些還可以把貓和狗，雞鴨鵝繼續(xù)分開。

我們之所以能夠身份賦值成功，是因為先驗知識，我們本來就認識這些動物。試想如果我們原先不認識羊駝這種動物，數(shù)量又不大，那就很有可能把比如7、8只羊駝分到綿羊一堆里，也就是假陰性：沒有羊駝。

同理，如果成年人腦神經(jīng)干細胞與小鼠、豬、猴子、人類幼年的這些先驗知識都不相似呢？

比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 這20萬細胞核已經(jīng)成功捕獲了神經(jīng)干細胞，但是沒有認出來（假陰性），卻隱匿在了星形膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞，少突細胞，interneuron群里。

好在成年人腦神經(jīng)干細胞一旦被單細胞測序成功捕獲了，隨著技術(shù)進步可以測更高通量的細胞和測序深度增加（各個平臺都有這樣新的解決方案推出），這個干細胞cluster理論上應(yīng)該冒出來。雖然也許這個cluster會與，比如，膠質(zhì)細胞或者內(nèi)皮細胞共用很多個標志基因，但測序分辨率夠了應(yīng)該能找到區(qū)別。

更為重要的，成年神經(jīng)元生發(fā)作為一個過程，軌跡（trajectory）應(yīng)該是存在、可測且清晰。

因為如果最終發(fā)現(xiàn)某些astrocytes或者microglia類細胞有神經(jīng)干細胞功能，它們不可能瞬間身份轉(zhuǎn)換成與某種原有成年腦細胞一模一樣，所以通過轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)該可以鑒定出來。

就算轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的聚類和軌跡分析都不能賦值鑒定成年神經(jīng)干細胞（若存在，且捕獲），那還可以嘗試基于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的聚類和軌跡分析，包括增強子enhancer特征，等等。在多組學(xué)這個趨勢下，單細胞（核）DNA甲基化特征，lncRNA特征，單細胞ChIP-seq也早晚都會進入市場成為有用的工具。

如果以上方法還是無法找到成年神經(jīng)干細胞，說明什么？

一個可能性是成年人腦中的類干細胞和類神經(jīng)元生發(fā)過程在正常生理狀態(tài)下處于靜息或受抑制狀態(tài)。

例如，最新的一項研究發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠大腦的海馬區(qū)衰老的神經(jīng)干細胞抑制了其附近正常干細胞的分裂和分化功能。通過化學(xué)手段去除老化的干細胞可以大大促進正常神經(jīng)干細胞的分裂與分化。

同理，成年人類大腦中的神經(jīng)干細胞可能也是需要某些條件激活的，比如損傷，某種疾病，特定遺傳，或者環(huán)境背景。這類的調(diào)節(jié)未必是線性的也許是個動力系統(tǒng)，所以前途仍然是光明的。

隨著更多數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，特別是那些染色找到成年人腦神經(jīng)干細胞的課題組，可應(yīng)用多組學(xué)單細胞（核）測序來確證自己的發(fā)現(xiàn)。

舊的bulk tissue mRNA-seq也是個寶庫（通常都存在GEO數(shù)據(jù)庫），因為很多是某種背景或者損傷的樣品，未必能找到同等的再去做單細胞測序。結(jié)合單細胞測序標志庫，現(xiàn)在有很多建立的數(shù)據(jù)分析流程 [3] 可以把bulk-seq做反卷積（deconvolution）看其中各個細胞成分的差異基因。

另外，經(jīng)常聽到的單細胞測序的其它缺陷，比如組織酶解消化過程會改變細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄組，或者造成transcripts丟失。我們自己的經(jīng)驗也發(fā)現(xiàn)成年動物腦組織酶解消化過程，如果條件沒有最佳化，會造成大量細胞丟失。

新推出的一些測序方案也許可以克服這些缺陷，使得測量結(jié)果更加原汁原味。

比如，spatial sequencing可以將組織切片的 “像素點” 不經(jīng)酶消化直接原位轉(zhuǎn)化成 “單細胞” 再測序。又如單細胞測序后通過組織切片F(xiàn)ISH RNAscope驗證可以找到不受樣品消化影響的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

成年人大腦中約有800億個神經(jīng)元，以及大約等同或稍多數(shù)量的膠質(zhì)細胞和其它細胞。

嚴格來講，要知道這每人1600億個細胞群體中 “有” 還是 “沒有” 神經(jīng)干細胞和成年新生神經(jīng)元，如果找到了要下結(jié)論 “有”，那么一個關(guān)鍵問題是如何確定找到的細胞是神經(jīng)干細胞？這1600億細胞群體中，神經(jīng)干細胞大概占多少？

如果沒找到，下結(jié)論 “沒有”，那么一個重要的問題是樣品的覆蓋率和數(shù)量是否足夠？比如用單細胞測序，每次抽樣20萬個細胞，要測多少次才能下結(jié)論？要考慮是否經(jīng)得起統(tǒng)計學(xué)方面的檢驗。

在多組學(xué)大數(shù)據(jù)的時代，讓成年人腦神經(jīng)干細胞探尋的子彈再飛一會兒。

 參考文獻：

1. Frantic D, Skarica M, Ma S, Arellano JI, Tebbenkamp ATN, Choi J, Xu C, Li Q, Morozov YM, Andrijevic D, Vrselja Z, Spajic A, Santpere G, Li M, Zhang S, Liu Y, Spurrier J, Zhang L, Gudelj I, Rapan L, Takahashi H, Huttner A, Fan R, Strittmatter SM, Sousa AMM, Rakic P, Sestan N. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 2021 Nov 18:S0896-6273(21)00866-7. doi: 10.1016/j.neuron.2021.10.036. Epub ahead of print. PMID: 34798047.

2. Ayhan F, Kulkarni A, Berto S, Sivaprakasam K, Douglas C, Lega BC, Konopka G. Resolving cellular and molecular diversity along the hippocampal anterior-to-posterior axis in humans. Neuron. 2021 Jul 7;109(13):2091-2105.e6. doi: 10.1016/j.neuron.2021.05.003. Epub 2021 May 28. PMID: 34051145; PMCID: PMC8273123.