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線粒體基因也能編輯了，距離治病還有多遠？

2020/07/21
導(dǎo)讀
第一例線粒體DNA精確編輯的分子工具

Credit：ANGELA GAO


撰文 | 秦芳菲
責編 | 湯佩蘭

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2020年7月14日，由哈佛大學(xué)布羅德研究所化學(xué)生物學(xué)家劉如謙（David  R.Liu）與華盛頓大學(xué)微生物學(xué)家 Joseph Mougous 合作有關(guān)基因編輯論文在《自然》發(fā)表，開發(fā)出了 “第一例線粒體DNA精確編輯的分子工具” [1]。
 
“該工具在人體細胞的實驗室實驗中發(fā)揮了作用，可能開啟一扇新的研究之門，以及未來數(shù)十種難以治療的由線粒體 DNA (mtDNA)突變引起的疾病的新療法?！?/span>《科學(xué)》雜志對該技術(shù)評價道 [2]。

過去幾年，圍繞 CRISPR 研究，David Liu 在堿基編輯范圍，對特異性，精確性和體內(nèi)遞送方向均作出了顯著進展，并在基因編輯治療疾病方向也有深入研究 [3][4]。
 
但目前 CRISPR 技術(shù)都是進入細胞核中，改造染色體 DNA，可能用于治療細胞核遺傳物質(zhì)突變導(dǎo)致的疾病。對于人類細胞來說，不只細胞核中有 DNA，細胞質(zhì)的線粒體也存在 DNA，這些基因突變同樣會造成遺傳病。


圖1 線粒體 圖源lifespan[5]

 
線粒體內(nèi)的DNA編碼13種蛋白質(zhì)，雖然種類不多，但每一種都參與到細胞的能量供應(yīng)鏈中。線粒體DNA突變可能導(dǎo)致數(shù)十種代謝疾病，包括心肌病、Leber 遺傳性視神經(jīng)病變等，而且這些疾病至今沒有治愈方法。開發(fā)可以精確糾正線粒體DNA的基因編輯工具，將為治療這類疾病打開大門。
 
CRISPR 系統(tǒng)需要有一段向?qū)?RNA（gRNA）定位到基因組特定位置，而RNA是不能夠進入線粒體的（圖2）。因此，目前改造線粒體DNA的方法主要利用無RNA系統(tǒng)的核酸酶，包括轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和鋅指核酸酶（ZFN）（注：CRISPR、TALEN和ZFN為基因組編輯三大技術(shù)）融合到線粒體靶向信號序列上，引發(fā)環(huán)狀線粒體DNA 雙鏈斷裂成線性化的 DNA，再對 DNA 進行編輯。然而，線性化的線粒體 DNA 往往還沒有來得及修復(fù)就被迅速降解，從而容易引發(fā)不易被切斷的線粒體基因組的不均衡分布，細胞分裂過程造成異質(zhì)性。鑒于此方法不能用于改變線粒體 DNA 特定堿基，因易導(dǎo)致DNA降解也不能用于同質(zhì)線粒體 DNA 突變，而應(yīng)用受限。


圖2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)需要gRNA （圖源Thermo）


在研究細菌之間如何用毒素相互攻擊時，Mougous 與同事有一個偶然發(fā)現(xiàn)。一般來說，這些毒素屬于細菌脫氨酶，它們往往通過識別單鏈DNA（ssDNA）、RNA、游離核苷、核苷酸、核酸堿基或者其他的核苷酸衍生物，而不識別雙鏈 DNA（dsDNA）。因此，當科學(xué)家們研究新型毒素的作用時，往往用 dsDNA 作為對照。意外的是，他們發(fā)現(xiàn)了這種新型的細菌脫氨酶，雖然對 ssDNA 沒有效果，但是可以直接修改對照組 dsDNA 上的堿基，把其中的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（U），從而殺死細菌（圖3）。于是，他們將這種細菌毒素命名為 DddA (double-stranded DNA deaminase toxin A，雙鏈DNA脫氨酶毒素A)。

 
圖3 以往的細菌脫氨酶作用于單鏈DNA，不切割雙鏈DNA，而新發(fā)現(xiàn)的DddA可以切割雙鏈DNA，而對單鏈DNA無效
 
不過，這種細菌毒素對于人體細胞是有毒的，如果不加以控制，它將肆意破壞 DNA，將遇到的所有胞嘧啶（C）都進行突變。為了使其可以進行精準的線粒體 DNA 編輯而不對細胞造成損傷，科學(xué)家們設(shè)想了巧妙的辦法：他們找到毒性結(jié)構(gòu)域 DddAtox，根據(jù)結(jié)晶得到的 DddAtox 的活性口袋，將它一分為二，變成沒有活性的兩個片段，只有當它們到達特定位置后彼此融合，才恢復(fù)脫氨酶功能（圖4）。David Liu 將其稱之為 “馴服野獸” 的過程。
 

圖4 分割為N端和C端部分的DddAtox，只有當融合后，才能行使功能

 
接下來，在模式細胞人類人胚胎腎細胞 HEK293T 中，研究人員證實了DdCBE系統(tǒng)的編輯能力。他們測試了線粒體基因組中的5個基因，處理3~6天后，堿基編輯效率在4.6%~49%（圖5），脫靶效應(yīng)基本也在0.05%以下。
 
圖 5 DdCBE系統(tǒng)的編輯能力
 
Mootha 表示，“這是我的職業(yè)生涯中首次實現(xiàn)線粒體 DNA 的精準編輯，這是一次質(zhì)的飛躍。如果我們可以實現(xiàn)靶向突變，我們就可以開發(fā)疾病相關(guān)突變的研究，并發(fā)展有效的治療藥物?！?[6] 不過，David Liu 對《自然》雜志表示，這距離應(yīng)用到臨床還有很長的路要走，其他類型的細胞還有待研究 [7]。
 
據(jù)《自然》雜志報道，這種技術(shù)彌補了現(xiàn)有治療線粒體疾病的方法。目前，英國已經(jīng)批準了 “線粒體置換” 的方法，將卵細胞或者胚胎細胞中的線粒體置換為健康供體的卵細胞或者胚胎細胞的線粒體。劍橋大學(xué)線粒體遺傳學(xué)家 Michal Minczuk 表示，這種新型的編輯技術(shù)將使研究者們能夠糾正錯誤的突變，即使線粒體中沒有足夠的數(shù)目的DNA拷貝數(shù)。盡管真正的醫(yī)用還很遙遠，但是短期看來，研究者們就已經(jīng)可以通過利用該技術(shù)生成動物模型，來研究線粒體突變的影響 [7]。

 參考資料

[1]Mok, B. Y.;  de Moraes, M. H.;  Zeng, J.;  Bosch, D. E.;  Kotrys, A. V.; Raguram, A.;  Hsu, F.;  Radey, M. C.;  Peterson, S. B.;  Mootha, V. K.; Mougous, J. D.; Liu, D. R., A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 2020. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4

[2]https://www.sciencemag.org/news/2020/07/new-method-edit-cell-s-powerhouse-dna-could-help-study-variety-genetic-diseases

[3]Yeh, W.-H.;  Chiang, H.;  Rees, H. A.;  Edge, A. S. B.; Liu, D. R., In vivo base editing of post-mitotic sensory cells. Nature Communications 2018, 9 (1), 2184.

[4]Shen, M. W.;  Arbab, M.;  Hsu, J. Y.;  Worstell, D.;  Culbertson, S. J.;  Krabbe, O.;  Cassa, C. A.;  Liu, D. R.;  Gifford, D. K.; Sherwood, R. I., Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature 2018, 563 (7733), 646-651.

[5]The First Precision Gene Editing Tool for Mitochondrial DNA. https://www.lifespan.io/news/the-first-precision-gene-editing-tool-for-mitochondrial-dna/

[6]New molecular tool precisely edits mitochondrial DNA. https://www.sciencedaily.com/releases/2020/07/200708121436.htm

[7]Scientists make precise gene edits to mitochondrial DNA for first time. https://www.nature.com/articles/d41586-020-02054-5

 
 制版編輯 | 皮皮魚
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