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KArGO 的化學(xué)式和交聯(lián)反應(yīng)

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董夢(mèng)秋實(shí)驗(yàn)室與合作者近期在《Nature Communications》雜志上連續(xù)發(fā)表了兩篇論文，不斷提升基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù)。文章的題目分別是 “Improving mass spectrometry analysis of protein structures with arginine-selective chemical cross-linkers” 和 “A high-speed search engine pLink 2 with systematic evaluation for proteome-scale identification of cross-linked peptides”。

前者介紹了新型精氨酸特異性交聯(lián)劑ArGO和精氨酸/賴氨酸雙選擇性交聯(lián)劑KArGO的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，2019 年9月2日發(fā)表；后者介紹了快速精準(zhǔn)的新一代交聯(lián)鑒定軟件pLink 2以及完整、客觀的軟件評(píng)測(cè)方案，2019 年7月30日發(fā)表。

董夢(mèng)秋實(shí)驗(yàn)室一直致力于開(kāi)發(fā)和完善交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（英文全稱Chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry, 簡(jiǎn)稱CXMS或XL-MS）。CXMS利用化學(xué)交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體中空間距離足夠接近的兩個(gè)氨基酸通過(guò)共價(jià)鍵連接起來(lái)，酶切成肽段后用質(zhì)譜鑒定出交聯(lián)位點(diǎn)，從而獲取低分辨度結(jié)構(gòu)信息，幫助推斷蛋白質(zhì)在三維空間的折疊狀態(tài)以及蛋白-蛋白相互作用的大致區(qū)域。相比于晶體和冷凍電鏡技術(shù)， CXMS對(duì)樣品量和樣品純度要求低，可捕獲蛋白質(zhì)在溶液中的動(dòng)態(tài)，并且具有簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)。

因此，CXMS在過(guò)去十年中得到了廣泛應(yīng)用，常常助力解析大型蛋白質(zhì)復(fù)合體的精細(xì)結(jié)構(gòu)，以及尋找蛋白與蛋白之間直接相互作用的區(qū)域。作為先行者和推動(dòng)者，董夢(mèng)秋實(shí)驗(yàn)室與計(jì)算科學(xué)、有機(jī)化學(xué)和蛋白質(zhì)科學(xué)等領(lǐng)域的研究團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期密切合作，全方位發(fā)展交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，包括開(kāi)發(fā)軟件 (Yang B, Nat Meth 2012; Lu S, Nat Meth 2015)、交聯(lián)劑 (Tan D, eLife 2016; Zhang X, Anal Chem 2018)、新的方法流程和應(yīng)用 (Lu S, Nat Meth 2015; Gong Z, Biophys Rep 2015; Ding YH, Anal Chem 2016; Ding YH, J Biol Chem 2017)。

當(dāng)前交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的一個(gè)明顯局限是過(guò)分依賴氨基特異性的NHS酯交聯(lián)劑。此類交聯(lián)劑主要靶向賴氨酸，得到的結(jié)構(gòu)信息有限，對(duì)于缺少賴氨酸的蛋白或蛋白區(qū)段，這個(gè)缺陷尤其明顯。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)其他類型氨基酸的新型交聯(lián)劑成為亟待解決的問(wèn)題。

為了得到更豐富的結(jié)構(gòu)信息，董夢(mèng)秋實(shí)驗(yàn)室與北京大學(xué)雷曉光實(shí)驗(yàn)室合作開(kāi)發(fā)了靶向精氨酸的交聯(lián)劑。該系列交聯(lián)劑在含有1-3個(gè)單體單元的聚乙二醇兩端連接芳香基取代的乙二醛 (aromatic glyoxal)，稱為 ArGO1-3。ArGO可以共價(jià)連接兩個(gè)精氨酸的側(cè)鏈胍基，具有良好的選擇性，彌補(bǔ)了氨基交聯(lián)劑的不足，但在不同蛋白樣品上的表現(xiàn)參差不齊。為了改善性能和增加使用范圍，作者將ArGO交聯(lián)劑的一端換成了靶向賴氨酸的鄰苯二甲醛，并將其命名為KArGO。KArGO使蛋白質(zhì)表面更多的氨基酸殘基成為靶點(diǎn)，增加了結(jié)構(gòu)覆蓋度，在多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品上均表現(xiàn)出穩(wěn)定可靠的交聯(lián)效果。作者進(jìn)一步將KArGO應(yīng)用在CNGP和UtpA等蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)鑒定中，結(jié)果表明KArGO彌補(bǔ)了已有賴氨酸交聯(lián)劑的不足，提供了豐富的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)信息。

CXMS的另一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析?，F(xiàn)有的交聯(lián)肽段鑒定軟件多達(dá)幾十種。相同數(shù)據(jù)用不同軟件分析得到的結(jié)果不盡相同，甚至差異巨大，因此交聯(lián)質(zhì)譜領(lǐng)域迫切需要一套客觀、實(shí)用的軟件評(píng)測(cè)方案。在7月30號(hào)發(fā)表的pLink 2文章中，董夢(mèng)秋實(shí)驗(yàn)室協(xié)助中科院計(jì)算所賀思敏研究員領(lǐng)導(dǎo)的pFind團(tuán)隊(duì)建立了全面的評(píng)測(cè)體系，并對(duì)十種主流軟件進(jìn)行了評(píng)測(cè)和比較，其中包括2012年雙方合作開(kāi)發(fā)的pLink 1軟件 (Yang B, Nat Meth 2012) 及其升級(jí)換代版pLink 2。pLink 2整合了pLink 1和蛋白質(zhì)二硫鍵鑒定軟件pLink-SS (Lu S, Nat Meth 2015) 的所有功能，從內(nèi)核算法到圖形界面都煥然一新。在模擬數(shù)據(jù)集、合成肽段數(shù)據(jù)集、15N標(biāo)記數(shù)據(jù)集和陷阱庫(kù)方法等四種系統(tǒng)性評(píng)測(cè)實(shí)驗(yàn)中，pLink 2和pLink 1的靈敏度和準(zhǔn)確度都位居前兩名，遠(yuǎn)超其他軟件。以模擬數(shù)據(jù)集（譜圖幾近完美）測(cè)試結(jié)果為例，pLink 1 和 pLink 2在5%假發(fā)現(xiàn)率條件下的靈敏度和準(zhǔn)確度分別達(dá)到和超過(guò)99.8%。pLink 2還有非常明顯的速度優(yōu)勢(shì)；在變化交聯(lián)形式、數(shù)據(jù)規(guī)模和蛋白序列庫(kù)規(guī)模的20組評(píng)測(cè)中，pLink 2比pLink 1平均快40倍，比靈敏度和準(zhǔn)確度位居第三的Kojak軟件平均快3倍。從2018年元旦免費(fèi)公開(kāi)發(fā)布到文章發(fā)表的一年多時(shí)間里，pLink 2軟件已經(jīng)擁有1000多名用戶。世界七大洲中，除南極洲外，都有pLink 2用戶。