清華學(xué)者精確調(diào)控細(xì)胞在3D多孔生物材料支架中機(jī)械響應(yīng)的新方法
圖1：使用冰凍保護(hù)劑控制冰晶生長，實(shí)現(xiàn)對硬度和孔徑的獨(dú)立、精確調(diào)控
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該研究首次利用冰凍保護(hù)劑，對3D多孔生物支架材料的孔徑和硬度實(shí)現(xiàn)了獨(dú)立和精確的調(diào)控，并系統(tǒng)探究了成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對于材料孔徑和硬度的機(jī)械響應(yīng)特征和相關(guān)機(jī)制，為基于仿生3D多孔支架材料中的生物力學(xué)和組織工程研究提供了有力工具，為精確控制細(xì)胞3D微環(huán)境的物理特性提供了理論和實(shí)施基礎(chǔ)。
近年來生物力學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展已證明生物基質(zhì)材料的物理特性（如硬度）是構(gòu)成細(xì)胞微環(huán)境的重要特性，對細(xì)胞表型和功能（如粘附、增殖、遷移、分化、遺傳和表觀遺傳等）的調(diào)控至關(guān)重要。目前對于生物材料的生物力學(xué)研究局限于2D平面材料或僅具有納米孔的3D水凝膠，盡管3D大孔生物支架材料在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用，至今尚未能對其進(jìn)行系統(tǒng)性的生物力學(xué)研究，這是由于大孔支架材料最主要的兩個物理特性即支架的孔徑和硬度通常相互關(guān)聯(lián)，目前的制備手段（如靜電紡絲、冷凍干燥、致孔劑）很難對兩者進(jìn)行獨(dú)立調(diào)控以實(shí)現(xiàn)單一生物力學(xué)特性調(diào)控細(xì)胞行為的深入研究。
本研究中，杜亞楠教授課題組發(fā)現(xiàn)引入冰凍保護(hù)劑（如DMSO、甘油、甲醇）可對冰晶生長實(shí)現(xiàn)有效調(diào)控，并利用這一特性實(shí)現(xiàn)了對于多孔支架材料孔徑與硬度的獨(dú)立調(diào)控。研究者發(fā)現(xiàn)，在冷凍過程中，隨著冰晶生長，反應(yīng)液相中的DMSO被不斷濃縮，導(dǎo)致液相凝固點(diǎn)逐漸降低最終致使冰晶停止生長。理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明，最初反應(yīng)液中的DMSO濃度可決定最終形成冰晶的大小?；诖嗽?，通過調(diào)控交聯(lián)劑和冰凍保護(hù)劑的用量，可制備出源自各類原料組分（如明膠，透明質(zhì)酸/明膠復(fù)合材料），孔徑范圍在20-80 μm，微觀硬度范圍在20-190kPa的可獨(dú)立、精確調(diào)控孔徑和硬度的3D多孔支架材料。
本研究開發(fā)的此種簡單易行的多孔支架制備方法，使得系統(tǒng)研究材料結(jié)構(gòu)和硬度對細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)成為了可能。成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是在生長發(fā)育、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)等生理病理過程中發(fā)揮重要作用的兩類細(xì)胞，其對于細(xì)胞外基質(zhì)生物力學(xué)性質(zhì)的響應(yīng)對于病理研究及植入材料設(shè)計(jì)都具有重要意義。體外研究發(fā)現(xiàn)，人真皮成纖維細(xì)胞在大孔徑-較高硬度（80μm, 190 kPa）的材料中呈現(xiàn)出更激活的狀態(tài)（例如：高表達(dá)αSMA），且材料力學(xué)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)通過影響轉(zhuǎn)錄因子YAP的定位來調(diào)控成纖維細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)。巨噬細(xì)胞通?？蓸O化為促炎癥反應(yīng)的M1型細(xì)胞和促損傷修復(fù)的M2型細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞在小孔徑-較低硬度 (30 μm, 20 kPa）的材料中，傾向于極化為M1表型。
相反，在大孔徑-高硬度材料中，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2型特征。相應(yīng)的，在小鼠體內(nèi)皮下植入試驗(yàn)中，植入小孔徑-低硬度材料，會誘導(dǎo)更多炎性細(xì)胞如M1型巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)出顯著的促炎效果；在小鼠體內(nèi)皮膚修復(fù)模型中，植入大孔徑-高硬度材料對于皮膚修復(fù)愈合速度和纖維化的促進(jìn)作用最明顯，表明對于損傷修復(fù)的促進(jìn)效果。
圖2：a.體外試驗(yàn)巨噬細(xì)胞在小孔徑低硬度材料中呈現(xiàn)促炎激活表型。b.體內(nèi)皮膚損傷修復(fù)模型中，浸潤的巨噬細(xì)胞在小孔徑低硬度材料中呈現(xiàn)促炎激活表型
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了多孔支架材料孔徑對細(xì)胞表型調(diào)控的潛在機(jī)制。發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)控培養(yǎng)液滲透壓大小模擬不同孔徑對細(xì)胞產(chǎn)生的空間物理限制。在高滲環(huán)境下，普通2D培養(yǎng)和3D大孔徑培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都呈現(xiàn)出在3D小孔材料中的表型。表明材料孔徑對細(xì)胞的機(jī)械調(diào)控和由孔徑產(chǎn)生的物理限制 (physical confinement）有關(guān)。
本研究首次使用冰凍保護(hù)劑調(diào)控冰晶生長，從而在多孔生物支架材料中實(shí)現(xiàn)了孔徑和硬度的獨(dú)立、精確調(diào)節(jié)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都驗(yàn)證了多孔支架孔徑和硬度對于細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)的調(diào)控。以上研究結(jié)果為3D多孔生物支架材料的生物力學(xué)研究提供了有效平臺，同時對調(diào)控3D細(xì)胞微環(huán)境的物理特性和對于其在組織工程領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用提供了新的設(shè)計(jì)思路。
原文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41467-019-11397-1
注：本文轉(zhuǎn)載自清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院。
