康春生團(tuán)隊等學(xué)者發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥關(guān)鍵基因
圖片來自cnjiyin.com
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膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，其增殖和侵襲能力強，并且容易術(shù)后復(fù)發(fā)。表皮生長因子受體（EGFR）和它的III型突變體（EGFRvIII）是目前膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的重要驅(qū)動基因，也是癌癥治療的靶點，其導(dǎo)致的下游因子異常激活是腫瘤患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素[1]。
雖然目前很多化療藥物，如替莫唑胺（TMZ），亞硝基脲類和順鉑已經(jīng)顯示對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的臨床獲益，但這些藥物的治療效果仍不甚滿意，主要因為內(nèi)在的或獲得性的耐藥性[2,3]。而替莫唑胺仍是目前唯一的一線抗癌藥。
基于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的基因篩選系統(tǒng)使用表達(dá)sgRNA的慢病毒文庫造成大量蛋白失功能篩選，這種篩選方法具有高靈敏性和特異性，適合鑒定細(xì)胞生長依賴的關(guān)鍵基因和篩選介導(dǎo)耐藥的重要基因[4,5]。
2019年7月24日，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院康春生團(tuán)隊、首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院江濤教授以及天津醫(yī)科大學(xué)吳旭東教授合作在Advanced science上發(fā)表題為Genome-Wide CRISPR-Cas9 Screening Identifies NF-κB/E2F6 Responsible for EGFRvIII-Associated Temozolomide Resistance in Glioblastoma的文章，發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤耐藥的關(guān)鍵基因E2F6，并且NF-κB抑制劑JSH-23聯(lián)合TMZ可以更有效的治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，這為膠質(zhì)瘤的臨床治愈提供了新的途徑。
研究人員首先用慢病毒的空載體和EGFRvIII感染U87細(xì)胞以形成U87NC和U87EGFRvIII細(xì)胞系。然后將這些細(xì)胞用作體外實驗?zāi)Ｐ汀榱髓b定GBM細(xì)胞對TMZ耐藥的相關(guān)基因，應(yīng)用全基因組CRISPR-Cas9為基礎(chǔ)的篩選文庫，這種sgRNA慢病毒文庫包含123,411 sgRNAs，靶向20,914人類基因，包括19050蛋白編碼基因和1864個microRNA表達(dá)基因。兩種篩選均用DMSO和350μM的 TMZ分別處理0,7和14天。然后通過基因組中sgRNA序列擴(kuò)增后的高通量測序計算所有剩余細(xì)胞中的sgRNA覆蓋率。然后對每個基因的sgRNA進(jìn)行加權(quán)，分析這些基因。最終確定了E2F6和EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-Κb信號通路與TMZ耐藥非常相關(guān)。
研究人員通過數(shù)據(jù)分析和體內(nèi)外實驗進(jìn)一步證明了E2F6表達(dá)不僅與膠質(zhì)瘤的WHO分級相關(guān)，更是TMZ抗性基因。同時揭示了E2F6受EGFR/PI3K/AKT途徑中的H3K4me3和NF-κB調(diào)節(jié)。然后通過構(gòu)建人腦膠質(zhì)瘤來源的小鼠原位膠質(zhì)瘤模型，揭示了NF-κB抑制劑JSH-23聯(lián)合TMZ可以達(dá)到更好的治療效果。
CRISPR-Cas9是近年研究最具熱點的基因編程技術(shù)?；贑RISPR-Cas9的全基因組篩選文庫被多個研究證實是一個有效且簡單易行的生物學(xué)方法。本研究通過篩選后的sgRNA測序，并與過表達(dá)EGFRvIII所得的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)E2F6在EGFRvIII細(xì)胞中上調(diào)，并且是其中一個替莫唑胺耐藥相關(guān)基因。首先證明了E2F6是通過EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-κB通路調(diào)控的，并且，替莫唑胺誘導(dǎo)DNA損傷后的NF-κB磷酸化激活也是增加E2F6表達(dá)的重要組成部分。過表達(dá)E2F6的細(xì)胞明顯對替莫唑胺耐藥，而敲低E2F6的細(xì)胞對替莫唑胺敏感，這些現(xiàn)象也顯示E2F6是重要的替莫唑胺耐藥相關(guān)基因。抑制E2F6可以增加替莫唑胺敏感性，意味著E2F6抑制劑和替莫唑胺聯(lián)合治療可以增加對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治愈性。本研究不僅為膠質(zhì)瘤的治療提供了新靶點，更為其他腫瘤的耐藥治療的研究提供了新的方法。
天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院康春生教授和首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院江濤教授以及天津醫(yī)科大學(xué)吳旭東教授為共同通訊作者，黃凱，劉幸和李巖聲為共同一作。
參考文獻(xiàn)
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[3] Weller M, Cloughesy T, Perry JR, et al. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-oncology [J]. 2013, 15(1): 4-27.
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