挑戰(zhàn)生命基本公式：人工合成實現(xiàn)大腸桿菌全基因組重編碼
放大10000倍的大腸桿菌圖 ，Photo by Eric Erbe, digital colorization by Christopher Pooley。 來源：Wikipedia
撰文 | 黃宇翔
責(zé)編 | 陳曉雪
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長久以來，合成生物學(xué)家都懷有一個夢想：希望能有一天合成出完整的人類基因組。然而，這項工作的難度就好比要求你用四種顏色的小小玻璃珠，沿著北京市五環(huán)路按照指定的次序串上五圈，中間還不允許出錯！
理想還是要有的。最近，英國 MRC 實驗室研究員 Jason Chin 領(lǐng)導(dǎo)的團隊取得了階段性的勝利：他們成功為大腸桿菌（Escherichia coli）的完整基因組重編寫了遺傳密碼子 [1]。如果沿用上面的比喻，大致相當(dāng)于用玻璃珠準(zhǔn)確、不間斷地圍著一個400米的操場完整串了一圈。
通訊作者Jason Chin照片
來源：MRC網(wǎng)站（https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/jason-chin-awarded-the-2019-sackler-prize/）
“這是一個里程碑式的工作?！?哈佛大學(xué)教授 George Church 在接受美國媒體 STAT 采訪時評論說。
全基因組水平最大規(guī)模的密碼子重編寫
從大腸桿菌到哺乳動物細胞都遵守中心法則：DNA 經(jīng)過轉(zhuǎn)錄生成 mRNA，mRNA 經(jīng)過翻譯形成蛋白質(zhì)。在翻譯的過程中，每三個核苷酸組成一個密碼子，對應(yīng)一種氨基酸或者是終止信號。由于細胞存在64種密碼子，而參與翻譯的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸只有20種，其中存在著冗余性，因此研究者設(shè)想可以通過密碼子同義替換，在基因組中刪除特定的密碼子，進而可以將空閑出的密碼子用于編碼非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。
在這項研究中，Jason Chin 團隊通過人工合成、替換的方式，將大腸桿菌全基因組的64個密碼子成功縮減為61個，是目前全基因組水平上最大規(guī)模的密碼子重編寫工作。
該研究通過同義替換將大腸桿菌基因組的64個遺傳密碼子縮減為61個。 來源：Fredens et al,. Nature,2019
研究者將大腸桿菌約 4Mb 的基因組劃分為8個小節(jié)，每個小節(jié)再細分為長度 100kb 左右的4-5個的模塊。通過體外 DNA 合成構(gòu)建出一條條長度約10kb的片段，再借助酵母細胞的同源重組，研究者將十條左右的片段拼接為包含了長約100kb模塊的細菌人工染色體（Bacterial Artificial Chromosome, BAC）。
然后，基于此前 Jason Chin 開發(fā)的 REXER 技術(shù) [2]，研究者將 BAC 電轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞，再利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)將大腸桿菌基因組中的~100kb長的同源序列替換為人工合成的序列模塊。Jason Chin 設(shè)計的 BAC 在同源模塊兩端具有特殊的選擇標(biāo)記，因此能夠在大腸桿菌中可迭代地進行 REXER，每一輪循環(huán)替換約100kb基因組，最終實現(xiàn)將大腸桿菌的整個基因組都替換為人工合成的同源序列的目標(biāo)。
研究者在人工合成的基因組中將編碼絲氨酸的密碼子 TCG、TCA 分別替換為同義的 AGC、AGT，將終止密碼子 TAG 全部替換為 TAA。在大腸桿菌 MDS42 株系中，以上三種替換所涉及變更的密碼子總計達18218個，新合成的株系被命名為 Syn61，用來紀(jì)念這個只含有61個密碼子的全新生命體。盡管在全基因組范圍內(nèi)，檢測到8個非預(yù)期突變，但研究者認(rèn)為這些突變對于相關(guān)基因的表達沒有影響。
該研究構(gòu)建的Syn61大腸桿菌基因組圖譜 來源：Fredens et al,. Nature, 2019
在2011年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院合成生物學(xué)家 George Church 成功將大腸桿菌的基因組中全部314個琥珀終止密碼子（amber stop codon，TAG）替換為同義的 TAA 終止密碼子。該研究是第一個在全基因組范圍內(nèi)實現(xiàn)密碼子重編寫的工作，但是其所主要使用的 MAGE 技術(shù)，是基于設(shè)計寡聚核苷酸鏈進行多位點同步替換的原理，僅僅可以對所要編輯的個別位點進行替換。George Church 的這項工作事實上并沒有實現(xiàn)對大腸桿菌全基因組的完全合成。同時，該工作所采用的基因編輯策略的固有特性限制了進一步擴大重編寫遺傳密碼子規(guī)模的可能性。[3]
2016年，George Church 又報道了將大腸桿菌密碼子由64個密碼子壓縮為57個密碼子的嘗試，提出了先將4Mb的基因組拆分成87個約50kb大小的片段并單獨構(gòu)造了片段替換的菌株，再整合到同一個基因組中的設(shè)想。[4]
“未來對全基因組遺傳密碼子的重編碼將會成為遺傳工程領(lǐng)域的一項巨大的飛躍，一旦實現(xiàn)，將意味著合成生物學(xué)從基礎(chǔ)科學(xué)向產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化的序幕正式被拉開?！?在談到在整個基因組范圍內(nèi)實現(xiàn)編碼氨基酸的遺傳密碼子同義壓縮的可能性時，哈佛大學(xué)教授 Don Ingber 在2013年表示 [5]。
今天， Chin 團隊正式實現(xiàn)了六年前 Don Ingber 所暢想的這項壯舉。
此項研究具有怎樣的意義？
“密碼子的重編寫挑戰(zhàn)了生命的基本公式，” 帝國理工學(xué)院的合成生物學(xué)家 Tom Ellis 在接受STAT 采訪時說，“你將可以利用自然提供給我們的原材料做一些完全不同的事情?！?Tom Ellis 解釋說，通過重編寫遺傳密碼子，人們將有可能在體內(nèi)合成含有非經(jīng)典氨基酸的新蛋白，這種新蛋白未來在臨床上具有潛在的醫(yī)學(xué)價值。
Church 在接受 STAT 采訪時則表示，Syn61 可能具有對病毒感染更好的抵抗性，假如應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)，有可能為生物制藥產(chǎn)業(yè)節(jié)省下由于病毒感染所導(dǎo)致的每年上百萬美元的經(jīng)濟損失。[6]
“密碼子同義壓縮的細菌未來將可以合成非經(jīng)典的生物聚合物，這具有生產(chǎn)新型材料和醫(yī)藥的潛力。” 該研究通訊作者 Jason Chin 告訴《知識分子》。
近些年來，合成生物學(xué)發(fā)展迅速，其安全性也一直備受關(guān)注，由于遺傳密碼子被重編寫的大腸桿菌可能對病毒產(chǎn)生抗性，因此一旦從實驗室環(huán)境泄露到外界，可能會超出人力所能控制的范圍。[7]
“Syn61菌株相比于野生型大腸桿菌生長速率較慢，預(yù)計在實驗室外競爭不過其他細菌?！?Chin 介紹說。他同時表示，“ 隨著合成生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，有必要進行廣泛的討論，以確保有合適的保護措施?！?nbsp;
參考文獻：
[1] Julius Fredens et al., (2019) Total synthesis of Escherichia coli with arecoded genome. Nature. DOI: 10.1038/s41586-019-1192-5
[2] Kaihang Wang et al., (2016) Defining synonymous codon compression schemes bygenome recoding. Nature. DOI: 10.1038/nature20124
[3] Isaacs,F.J et al., (2011) Precise manipulation of chromosomes in vivo enablesgenome-wide codon replacement. Science. DOI: 10.1126/science.1205822
[4] OstrovN et al., (2016) Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome.Science. DOI: 10.1126/science.aaf3639
[5] https://wyss.harvard.edu/radical-recoding/
[6] https://www.statnews.com/2019/05/15/recoded-bacteria-genome-made-from-scratch/
[7] John Bohannon, (2016) Biologists areclose to reinventing the genetic code of life. Science. DOI: 10.1126/science.aah7205
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