中國科學(xué)家重要突破：克隆猴“中中”“華華”來了 | 快訊
?中科院神經(jīng)所率先克隆出兩只猴：“中中”（左）和“華華”（右），圖片來自神經(jīng)所
“這項(xiàng)成果將不僅為動(dòng)物研究帶來革命性的變化，還會(huì)促進(jìn)人類疾病治療新方案的開發(fā)?！?/strong>
——《細(xì)胞》雜志主編Emilie Marcus
撰文 | 葉水送、呂浩然
責(zé)編 | 陳曉雪
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1997年，科學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了一件大事，它既引起了科學(xué)家群體的廣泛關(guān)注，同時(shí)又成為街談巷議的話題，這就是克隆羊“多莉”的誕生。20多年過去了，科學(xué)家利用體細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT）克隆出了許多其他哺乳動(dòng)物，如豬、牛、羊、貓、狗等。
事實(shí)上，這期間也有很多學(xué)者曾嘗試克隆與人類更加接近的非人靈長類動(dòng)物。1999年，俄勒岡國立靈長類研究中心Gerald Schatten教授成功地用胚胎分裂的方式克隆出一只恒河猴，但由于并未運(yùn)用體細(xì)胞核移植技術(shù)，所以并未引起廣泛關(guān)注。除此之外，俄勒岡美國國家靈長類中心Shoukhrat Mitalipov教授、匹茲堡大學(xué)Calvin Simerly等人也嘗試用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆非人靈長類動(dòng)物，均未成功。
近日，這一難題被來自中國科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所的科學(xué)家攻克，他們率先利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆出兩只獼猴，完成這一實(shí)驗(yàn)的是以中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所研究員孫強(qiáng)和博士后劉真為主的團(tuán)隊(duì)。
?體細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT）克隆出獼猴，圖片來自Cell
?非人靈長類體細(xì)胞克隆歷史，圖片來源：孫強(qiáng)
1月25日，《細(xì)胞》（Cell）雜志不同尋常地提前公布了這一重磅研究。
“這項(xiàng)成果將不僅為動(dòng)物研究帶來革命性的變化，還會(huì)促進(jìn)人類疾病治療新方案的開發(fā)?！薄都?xì)胞》雜志主編Emilie Marcus告訴《知識(shí)分子》。
值得注意的是，該論文從投稿到接收不到1個(gè)月時(shí)間，足以顯示《細(xì)胞》雜志編輯對(duì)該研究的重視。Marcus表示，“《細(xì)胞》雜志能有機(jī)會(huì)發(fā)表如此令人振奮的重要的研究成果，我們感到非常榮幸。我們一向致力于在保證每篇論文都經(jīng)過嚴(yán)格、公正審核的前提下，向大眾盡快地傳播能拓展新領(lǐng)域、有顯著意義的科研成果，這次也不例外。這篇論文的審稿人對(duì)論文的反饋，都非常迅速和肯定，再加上作者配合等因素，促成了這篇文章能在《細(xì)胞》雜志上快速發(fā)表。”
?克隆猴的簡易流程圖，圖片來自Cell
這兩只克隆猴擁有一個(gè)意味深長的名字：“中中”和“華華”，象征著“中華”。目前，兩只克隆猴出生時(shí)間分別為8周和6周，同普通的猴子一樣，能正常地生長。
在成功克隆猴之前，研究人員嘗試了不同的方法，均告失敗。“但只有一種方法最終奏效”，孫強(qiáng)表示。同時(shí)他也指出，在克隆猴子的過程中，有四個(gè)關(guān)鍵性的節(jié)點(diǎn)：胚胎構(gòu)建、卵細(xì)胞激活、核基因啟動(dòng)、著床后發(fā)育。如何攻克這四個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)于研究人員來說也是極大地挑戰(zhàn)。
研究顯示，已分化的猴細(xì)胞核對(duì)體細(xì)胞核移植技術(shù)有抗性，因此孫強(qiáng)與同事在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后，引入表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，打開或關(guān)閉抑制胚胎發(fā)育的基因。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向融合細(xì)胞中注入去甲基化酶Kdm4d的mRNA，去除組蛋白甲基化修飾，并用組蛋白去乙?；种苿㏕SA處理細(xì)胞時(shí)，能極大地改進(jìn)滋養(yǎng)體發(fā)育和在代孕母猴中成功懷孕的比例。
?兩組實(shí)驗(yàn)中克隆猴囊胚的發(fā)育比較，圖片來自Cell
在這項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)：一組是利用胎兒纖維組織母細(xì)胞，作為融合細(xì)胞的細(xì)胞核來源，這些細(xì)胞來自流產(chǎn)幼猴的組織；另一組實(shí)驗(yàn)，利用成年猴子的卵丘細(xì)胞作為融合細(xì)胞的細(xì)胞核來源。
?兩組實(shí)驗(yàn)懷孕及胎兒成功發(fā)育的比例，圖片來自Cell
兩組實(shí)驗(yàn)取得了不同的結(jié)果：在第一組實(shí)驗(yàn)中，21只代孕母猴中的6只成功懷孕，最終生下了2只健康的猴子，它們就是“中中”和“華華”；另一組研究，42只代孕母猴中有22只成功懷孕，最后也有兩只猴子出生，可惜的是，它們短暫存活后死亡。
?“Tetra”猴的克隆技術(shù)簡圖，圖片來自crystalinks.com
早在1999年，就有科學(xué)家克隆出了靈長類動(dòng)物，這是一只名為“Tetra”的克隆猴，只不過它的誕生是通過胚胎分裂的方法，即胚胎發(fā)育到8細(xì)胞時(shí)，人為地被分為2個(gè)4細(xì)胞的胚胎，再分別發(fā)育，該方法并非使用常規(guī)的動(dòng)物克隆技術(shù)體細(xì)胞核移植進(jìn)行，因此無論從科學(xué)意義還是實(shí)用性上，都比較受限。
但是，此次神經(jīng)所的工作系通過體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆猴子，難度更大。為建立體細(xì)胞核移植技術(shù)的流程，快速以及精準(zhǔn)地從卵細(xì)胞中取出細(xì)胞核，并促使體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合，論文的第一作者劉真博士花了3年時(shí)間練習(xí)以及優(yōu)化該流程。最終在表觀因子的刺激下，重新激活被抑制的基因，大大提高了胚胎發(fā)育的效率和代孕母猴成功懷孕的比例。
“體細(xì)胞核移植技術(shù)流程非常關(guān)鍵，操作越快，卵細(xì)胞受損就會(huì)越小，劉博士在這方面做的很出色?！敝锌圃荷窠?jīng)研究所所長、論文的合作者蒲慕明表示，“劉真可能在10秒之內(nèi)對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞去核操作，在15秒之內(nèi)將體細(xì)胞注入到卵母細(xì)胞當(dāng)中。這需要很長的練習(xí)，并非每個(gè)人都能精準(zhǔn)且快速地操作去核、細(xì)胞融合，流程的優(yōu)化極大地幫助了我們。”
截至目前，已經(jīng)有23種哺乳動(dòng)物通過體細(xì)胞核移植的方法被成功克隆，它們有的作為動(dòng)物模型用在科研中，有的則作為人類潛在的器官供體來源（例如克隆豬）。越接近于人類，動(dòng)物模型應(yīng)用的價(jià)值越大，與此同時(shí)克隆的難度也越大。
為何靈長類動(dòng)物的克隆會(huì)更難？江蘇省異種移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、“千人計(jì)劃”學(xué)者戴一凡表示，“不同物種之間卵子成熟、胚胎發(fā)育條件都不一樣，靈長類取卵的成本很高，不能做很多試驗(yàn)摸條件?！彼瑫r(shí)表示，“只要測(cè)試很多不同的條件或找到最佳條件，克隆猴的出現(xiàn)也是遲早的事?！贝饕环舱谘芯靠寺∝i作為異體器官供體來源，他此前在PPL治療公司（PPLTherapeutics）工作，該公司擁有非常輝煌的過往，曾資助多莉羊的克隆實(shí)驗(yàn)，并與英國愛丁堡Roslin研究所共同克隆出多莉羊。
考慮到第一頭克隆羊“多莉”的壽命僅有7年，一個(gè)顯而易見的問題是：利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆的動(dòng)物，壽命是否會(huì)減少？對(duì)此戴一凡表示：“克隆對(duì)動(dòng)物的壽命應(yīng)該沒有影響，多莉羊是因?yàn)楦腥玖瞬《径矘匪赖?，不是因?yàn)樗ダ隙??！?/p>
談到此次“中中”“華華”問世的意義，蒲慕明表示：“體細(xì)胞克隆猴的成功將推動(dòng)中國率先發(fā)展出基于非人靈長類疾病動(dòng)物模型的全新醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)針對(duì)阿爾茨海默病、自閉癥等腦疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進(jìn)程，同時(shí)也讓中國成為世界腦科學(xué)人才的匯聚高地?！?/p>
理想的動(dòng)物模型是人類探究疾病、進(jìn)行基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)的重要工具。一直以來，科學(xué)家孜孜不倦地追求理想的動(dòng)物模型，尤其是對(duì)靈長類動(dòng)物模型的構(gòu)建。
“有關(guān)靈長類的很多研究問題，都可以通過這一技術(shù)構(gòu)建的靈長類動(dòng)物模型得到解答?！睂O強(qiáng)表示，“通過克隆技術(shù)，我們可以生產(chǎn)出遺傳背景一致的猴子，可以用在大腦疾病、癌癥、免疫甚至代謝類疾病研究方面，亦可以幫助我們?cè)谒幬锱R床前試驗(yàn)中，檢測(cè)其有效性?！?/p>
同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授、“千人計(jì)劃”學(xué)者孫毅亦表示，“長遠(yuǎn)來看，靈長類動(dòng)物做疾病模型優(yōu)勢(shì)巨大，目前很多疾病的分析方法還沒有完全在靈長類模型上成熟應(yīng)用，不過這也是時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的問題。研究靈長類和研究人類有很多相似性，由于能收割猴的組織直接分析，從而會(huì)協(xié)助和建立無創(chuàng)或微創(chuàng)方法用于臨床，意義重大?！?017年，孫毅同昆明理工大學(xué)季維智院士、陳永昌教授合作，在《細(xì)胞》雜志發(fā)表利用TALEN技術(shù)，構(gòu)建瑞特綜合征（Rett syndrome，RTT）的食蟹猴模型。
目前，靈長類動(dòng)物模型的構(gòu)建的有哪些？克隆的方式有優(yōu)勢(shì)嗎？孫毅就此介紹說，“靈長類動(dòng)物模型有多種，對(duì)于遺傳性疾病，就需要進(jìn)行基因編輯。目前，有通過病毒載體的方法用于受精卵或直接在體特異性地干預(yù)，也有通過對(duì)受精卵做TALEN 、CRISPR/Cas9的基因編輯?！彼赋觯叭绻寺『锏谋碛^遺傳特征和正常體外受精（IVF）的胚胎及出生后個(gè)體很相似，那么先在體細(xì)胞里做全方位的基因編輯和精細(xì)檢測(cè)，然后通過核移植進(jìn)一步得到所需的疾病模型，會(huì)很有優(yōu)勢(shì)。前提是克隆的表觀遺傳特征是正常的，否則就繞更大的彎路了。對(duì)克隆來說，最大的擔(dān)心就是表觀遺傳的不正常?！?/p>
值得一提的是，此次實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地遵循美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）國際動(dòng)物研究指導(dǎo)條例。但孫強(qiáng)和蒲慕明仍鼓勵(lì)科學(xué)群體對(duì)動(dòng)物研究的倫理問題進(jìn)行深入討論：非人靈長類動(dòng)物克隆研究可接受的操作是什么、不可接受的操作是什么?！拔覀兦逦匾庾R(shí)到，未來非人靈長類動(dòng)物的研究，科學(xué)家應(yīng)需嚴(yán)格地遵循當(dāng)?shù)氐膫惱頊?zhǔn)則?！逼涯矫鞅硎?。
參考文獻(xiàn)：
Zhen Liu, Yijun Cai, Yan Wang, Yanhong Nie, Chenchen Zhang, Yuting Xu,Xiaotong Zhang, Yong Lu, Zhanyang Wang, Muming Poo, and Qiang Sun. Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell, 2018. 172, 1–7. DOI:10.1016/j.cell.2018.01.020.
Meet Zhong Zhong and Hua Hua, the first monkeyclones produced by method that made Dolly.
