一個(gè)“不受歡迎”的研究，是怎樣發(fā)現(xiàn)了35億年進(jìn)化史中的生物鐘密碼？
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晨曦中向日葵逐日綻放，暮色里招潮蟹候月出穴，子夜里螢火蟲點(diǎn)星閃爍……這些生物活動(dòng)的規(guī)律，正是體內(nèi)精密的時(shí)間機(jī)制在調(diào)控，讓生命節(jié)奏與晝夜更替、季節(jié)變化保持同步。
然而，幾十年來，當(dāng)科學(xué)家們?cè)噲D解碼這精密的生物鐘機(jī)制時(shí)，卻始終被時(shí)間的周期困住。
生物鐘的轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路（TTFL）模型已于 2017 年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，它揭示了一條基因表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)控通路：時(shí)鐘基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生mRNA，翻譯形成時(shí)鐘蛋白，時(shí)鐘蛋白積累到一定水平后抑制自身基因的轉(zhuǎn)錄，隨著時(shí)鐘蛋白的降解，抑制作用減弱，基因轉(zhuǎn)錄重新開始——這一輪循環(huán)，在體內(nèi)，或者說細(xì)胞內(nèi)，周期剛好是24小時(shí)左右；但當(dāng)我們?cè)隗w外試圖重構(gòu)與轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋相關(guān)的循環(huán)，最多只能清晰地刻畫出大約6小時(shí)的周期變化。消失的時(shí)間去了哪里？究竟是什么“拖慢”了時(shí)間的腳步？在諾獎(jiǎng)中我們不能找到這個(gè)問題的答案。那么，是否還存在著其他未知的通路？
2025年3月，一項(xiàng)突破性發(fā)現(xiàn)為其提供了關(guān)鍵線索。
北京生命科學(xué)研究所高級(jí)研究員張二荃研究團(tuán)隊(duì)在《自然》雜志上揭示了一種名為RUVBL2的P-環(huán)NTP酶在生物鐘調(diào)控中的核心作用（《The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes》）。這種 “異常緩慢”的ATP水解酶，每天僅處理約13個(gè)ATP分子。
圖源：
https://www.nature.com/articles/s41586-025-08797-3
要理解這種緩慢的程度，不妨考慮一些“普通”ATP酶的運(yùn)轉(zhuǎn)速度：肌球蛋白，這種在肌肉收縮中至關(guān)重要的馬達(dá)蛋白，每秒可以水解約10個(gè)ATP分子；線粒體中的F1-ATP酶這臺(tái)能量轉(zhuǎn)換工廠每秒處理近100個(gè)ATP；而最為高效的酶如碳酸酐酶，每秒能催化多達(dá)100萬次反應(yīng)。
張二荃團(tuán)隊(duì)通過突變RUVBL2基因，獲得了酶活性更高或更低的突變體，發(fā)現(xiàn)可精確將其晝夜周期調(diào)控到22小時(shí)到30小時(shí)。正是這種“緩慢”的特質(zhì)，讓它能夠精確地度量時(shí)間，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的晝夜節(jié)律周期。
圖1 RUVBL2是生物鐘的核心組成成分(改編自原文)
(a) 在細(xì)胞中敲入突變會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)周期、短周期或無節(jié)律的表型，而在小鼠SCN過表達(dá)RUVBL2突變體可重現(xiàn)長(zhǎng)周期和短周期的節(jié)律變化。此外，細(xì)胞與小鼠的周期表型呈線性相關(guān)。(b) 在小鼠SCN中敲除Ruvbl2會(huì)導(dǎo)致其在恒定黑暗條件下喪失活動(dòng)節(jié)律。圖源：清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院官網(wǎng)
這樣的機(jī)制并非首次被發(fā)現(xiàn)。早在2005年，日本科學(xué)家近藤孝男（Takao Kondo）實(shí)驗(yàn)室就在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)了KaiC蛋白及其“伙伴”KaiA和KaiB。只要在試管中加入ATP，這三個(gè)純蛋白就能自發(fā)形成24小時(shí)周期。KaiC通過緩慢的磷酸化和去磷酸化過程，在KaiA的促進(jìn)和KaiB的抑制下，精確地維持著晝夜節(jié)律。
這曾讓科學(xué)界興奮不已，以為即將解開生物鐘周期之謎，但隨后20年里，科學(xué)家們卻始終未能在其他生物中找到類似的機(jī)制。漸漸地，人們開始認(rèn)為KaiC系統(tǒng)可能只是進(jìn)化長(zhǎng)河中的一個(gè)偶然。“這套系統(tǒng)實(shí)在過于精妙，出現(xiàn)一個(gè)就很了不起，怎么可能有這么多？”，并提出“生物鐘是多中心多起源，協(xié)同進(jìn)化”。真核生物的生物鐘似乎完全依賴于基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路（TTFL）。
但張二荃認(rèn)為這套說法并不能讓人信服，“生物都接受著同樣的光照，感受著相同的地球脈搏，怎么會(huì)是多中心起源呢？”
直到2014年，他們?cè)谝淮闻既坏母淖兩镧姷幕衔锖Y選計(jì)劃中迎來了轉(zhuǎn)機(jī)，他們發(fā)現(xiàn)一種核苷化合物蟲草素（cordycepin），能導(dǎo)致時(shí)鐘基因表達(dá)相位完全逆轉(zhuǎn)。順著這條線索，他們找到了關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白RUVBL2。讓人驚喜的是，這個(gè)AAA+家族的ATP酶與KaiC驚人地相似：都具有極其緩慢的ATP水解速率，抑制它們都能產(chǎn)生精確的時(shí)間延遲。
圖2 在人源RUVBL1/RUVBL2復(fù)合物的ATP結(jié)合口袋中，水分子的位置與藍(lán)藻KaiC相似，都處在一種非優(yōu)化的進(jìn)攻ATP γ-磷酸基團(tuán)的狀態(tài)，因而決定了它們是一類極慢速的ATP水解酶。圖源：清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院官網(wǎng)
與原核生物中的KaiC不同的是，RUVBL2在真核生物的生物鐘調(diào)控中具有跨物種保守性，從人類到果蠅，再到脈孢菌，張二荃都在其身上找到了同源蛋白并完成了驗(yàn)證。
這是一條完全獨(dú)立于傳統(tǒng)TTFL機(jī)制的通路，張二荃團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。他們聚焦于TTFL模型中兩個(gè)關(guān)鍵的時(shí)鐘基因CRY1和CRY2。這對(duì)基因在生物鐘調(diào)控中扮演著相反的角色：降低CRY1會(huì)縮短周期，而降低CRY2則會(huì)延長(zhǎng)周期。研究人員發(fā)現(xiàn)，無論是在具有高ATP酶活性（周期縮短）的RUVBL2突變體中，還是在低活性（周期延長(zhǎng)）的突變體中，CRY1和CRY2的這種調(diào)控效應(yīng)都完整保留。更重要的是，RUVBL2的效應(yīng)與CRY的效應(yīng)呈簡(jiǎn)單疊加關(guān)系，而非相互影響。
緩慢震蕩的ATP酶，保管著35億年進(jìn)化史中最寶貴的節(jié)奏。從藍(lán)藻的海洋微光到真核細(xì)胞的誕生，從恐龍時(shí)代的哺乳動(dòng)物到直立行走的露西，RUVBL2始終以每天大約13次ATP水解的節(jié)奏，在基因組中刻下時(shí)間密碼。
時(shí)鐘振蕩器里，六個(gè)RUVBL2分子首尾相連，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過緩慢但持續(xù)的構(gòu)象變化來丈量時(shí)間。每當(dāng)一個(gè)ATP分子被水解，就會(huì)引發(fā)六聚體中的一處構(gòu)象改變。由于每天只水解13個(gè)ATP，平均每?jī)尚r(shí)才完成一次構(gòu)象轉(zhuǎn)換。隨著時(shí)間推移，這些微小的構(gòu)象變化逐漸累積。到12小時(shí)時(shí)，六聚體已經(jīng)發(fā)生了顯著的結(jié)構(gòu)重排，就像一個(gè)金屬環(huán)被逐漸扭轉(zhuǎn)變形。24小時(shí)后，六聚體完成一個(gè)完整的構(gòu)象循環(huán)，回到初始狀態(tài)，準(zhǔn)備開始下一輪周期。
在尋找這些“消失時(shí)間”的過程中，RUVBL2的故事為這個(gè)崇尚效率的時(shí)代，提供了一個(gè)反直覺的教訓(xùn)：生命選擇了緩慢作為其計(jì)時(shí)策略，不是因?yàn)樗鼰o法更快，而是因?yàn)樗恍枰?。?dāng)我們?cè)噲D用咖啡因、人工照明和不規(guī)律的作息來打破這個(gè)古老系統(tǒng)時(shí)，我們實(shí)際上是在與進(jìn)化精心設(shè)計(jì)的、以“緩慢”為基礎(chǔ)的生物節(jié)律作對(duì)抗。
01
張二荃開啟這項(xiàng)化合物篩選計(jì)劃時(shí)怎么也沒有想到，自己會(huì)找到生物鐘進(jìn)化中的核心分子RUVBL2，他當(dāng)時(shí)只是樸素地以為，生物鐘調(diào)控目前缺乏藥物。
周期、振幅和相位是描述生物鐘振蕩的三大參數(shù)。他刻意避開了基礎(chǔ)科學(xué)中最重要的問題——周期，反而瞄準(zhǔn)了不那么受關(guān)注的相位和振幅。它們只能解決實(shí)用性的問題，諸如幫助旅行者快速適應(yīng)新時(shí)區(qū)，幫助輪班工作者調(diào)整作息，緩解季節(jié)性情緒障礙，改善老年人的睡眠等等。
這樣的選擇也為他研究的命運(yùn)埋下了伏筆，它注定不是一個(gè)“受歡迎”的研究。
從近萬種候選化合物中，他們發(fā)現(xiàn)蟲草素能完全逆轉(zhuǎn)生物鐘的節(jié)律，造成12小時(shí)的相位偏移。更重要的是，這種效果強(qiáng)烈依賴給藥時(shí)間，呈現(xiàn)“0型重置”特征——就像時(shí)鐘指針突然跳轉(zhuǎn)，而不是緩慢調(diào)整。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，注射蟲草素的小鼠只需4天就能適應(yīng)8小時(shí)的時(shí)差，比正常情況快了一倍。而在特定的時(shí)間，還能發(fā)揮提高振幅的效果。
這條代表著生物鐘的正弦曲線有了蟲草素的參與變得更加強(qiáng)勁、相位轉(zhuǎn)變更加迅速，這讓它贏得了中國、日本等多國的專利，提上了商業(yè)化的日程。
但是尋找蟲草素的靶點(diǎn)一直是作為科學(xué)家的張二荃的使命。他猜了很久，希望閃光的運(yùn)氣能夠降臨，每一次晚飯后散步、開會(huì)間隙偶然地遐想都會(huì)把他帶到一個(gè)分子上，學(xué)生們?cè)倩ㄉ蠋滋?/span>甚至幾周的時(shí)間去實(shí)驗(yàn)卻一無所獲，一來二去大失所望。
不像其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，生物鐘實(shí)驗(yàn)無法在24小時(shí)內(nèi)快速試錯(cuò)、迭代假設(shè)。每個(gè)time course實(shí)驗(yàn)都需要96小時(shí)的持續(xù)監(jiān)測(cè)，一個(gè)完整的數(shù)據(jù)集往往要等待兩到三個(gè)完整周期才能顯現(xiàn)規(guī)律，而時(shí)間早溜走一星期。
凌晨的實(shí)驗(yàn)室，熒光素酶記錄儀發(fā)出微弱的綠光，疲憊的學(xué)生仍在記錄新一輪的數(shù)據(jù)。盡管實(shí)驗(yàn)室配備了自動(dòng)化設(shè)備，但生物鐘的研究依然考驗(yàn)著每個(gè)人的耐心與毅力。“決戰(zhàn)96小時(shí)”成了實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)配，而這種不規(guī)律的作息卻諷刺地打亂了研究生物鐘的人自己的生理節(jié)律。
猜了兩年，學(xué)生終于熬不住了，找他申訴，“我馬上就要畢業(yè)了，不能再一直這樣做下去”。做“恐龍級(jí)”課題的同行告訴他，“沒有用，快點(diǎn)去做篩選吧”。他深知，在分子生物學(xué)領(lǐng)域，高通量篩選是標(biāo)準(zhǔn)方法論。但他另一方面又認(rèn)為，科學(xué)不應(yīng)該只是機(jī)械地篩選萬千分子，真正的科學(xué)突破往往源于敏銳的直覺和深刻的思考。
他坦言，那段時(shí)間最有壓力的不是自己，老板們忙于各種各樣的課題，“東方不亮西方亮”，對(duì)時(shí)間的流逝沒有太多的感知，研究機(jī)構(gòu)也有很好的支持，反倒是學(xué)生承擔(dān)了繁瑣的重復(fù)勞動(dòng)和時(shí)間壓力。
最終，張二荃還是不得不放棄執(zhí)念，選擇了高通量篩選，通過功能篩選和物理相互作用篩選相結(jié)合的方式找到了RUVBL2。而在RUVBL2的發(fā)現(xiàn)讓實(shí)驗(yàn)室沸騰之際，張二荃卻收到了《科學(xué)》雜志的拒稿信。“這不夠基礎(chǔ)”，審稿人如此評(píng)價(jià)。六年的心血，最終只能發(fā)表在一本轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)期刊上。這個(gè)結(jié)果讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)室都感到些許失落。
但張二荃并未因此止步。在研究蟲草素的過程中，他們意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用脫氨酶抑制劑時(shí)，蟲草素半衰期不僅得到延長(zhǎng)，還能顯著影響生物鐘周期。這個(gè)發(fā)現(xiàn)讓他重新燃起了希望，也許RUVBL2還是打開生物鐘周期調(diào)控之門的鑰匙。
這篇關(guān)于蟲草素的研究發(fā)表后，實(shí)驗(yàn)室迎來了新一批充滿熱情的學(xué)生。2023年起，張二荃帶領(lǐng)他們開展了一項(xiàng)新的計(jì)劃：利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)RUVBL2進(jìn)行定向基因突變篩選。
22個(gè)短周期突變體，302個(gè)長(zhǎng)周期突變體，55個(gè)完全失去節(jié)律的突變體。這種雙向性的周期改變，在生物鐘研究史上極為罕見，此前只在果蠅period等少數(shù)核心生物鐘基因中觀察到過。“這證實(shí)了RUVBL2確實(shí)是一個(gè)真正的生物鐘基因”，張二荃說道。
更令人興奮的是，當(dāng)他們對(duì)這些突變體進(jìn)行測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)許多關(guān)鍵突變都集中在Walker A結(jié)構(gòu)域周圍，這個(gè)區(qū)域正是負(fù)責(zé)ATP酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。
兩篇文章明顯“頭重腳輕”，一篇工作耗時(shí)更久，打下了基礎(chǔ)但鮮少被人注意，第二篇工作花費(fèi)時(shí)間短，但引人矚目，這是否會(huì)讓作者感到不平衡？張二荃笑著說道，“還好，我們都‘內(nèi)部消化’了。第二篇文章的第一作者剛好是第一篇文章作者的太太”。
02
在那場(chǎng)尋找KaiC系統(tǒng)失敗的旅程后，生物鐘領(lǐng)域被一種二元分化的思想所主導(dǎo)。
多數(shù)研究者認(rèn)為藍(lán)藻中那套神奇的KaiABC系統(tǒng)是原始生物特有的孤例，一種進(jìn)化的“死胡同”，與真核生物復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路毫無關(guān)聯(lián)。在這種主流觀點(diǎn)之外，另有少數(shù)學(xué)者堅(jiān)持尋找共同機(jī)制，但他們的焦點(diǎn)幾乎全部集中在KaiC的自發(fā)磷酸化/去磷酸化循環(huán)上，視之為可能的共同祖先機(jī)制。
張二荃團(tuán)隊(duì)的發(fā)現(xiàn)徹底打破了這一范式。他們證明了生物鐘的核心機(jī)制既不是KaiABC系統(tǒng)的特有屬性，也不是磷酸化/去磷酸化循環(huán)，而是一種此前被忽視的特性，極其緩慢的ATP水解酶活性，也是過去二十年科學(xué)界尋找Kai C系統(tǒng)功虧一簣的原因。
當(dāng)張二荃比較兩個(gè)分子的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩者在氨基酸序列上存在很大差異，相似度不到 10%，但它們?cè)?/span>ATPase結(jié)構(gòu)域的氨基末端（約 80 個(gè)）卻表現(xiàn)出極為相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因?yàn)?/span> KaiC 和 RUVBL2 都屬于一個(gè)稱為 P 環(huán)NTPases的超家族。
為何如此之慢？答案隱藏在分子結(jié)構(gòu)的精妙細(xì)節(jié)中。
在高分辨率晶體結(jié)構(gòu)中，研究人員觀察到了RUVBL蛋白的活性位點(diǎn)有一個(gè)特殊的構(gòu)型：負(fù)責(zé)水解ATP的水分子，所謂的“裂解水”，被刻意放置在一個(gè)“尷尬”的位置。就像一位投手被迫以不自然的角度投球，這個(gè)水分子必須從一個(gè)不利的角度和距離發(fā)動(dòng)對(duì)ATP γ-磷酸的進(jìn)攻。
這種結(jié)構(gòu)上的“不便”并非缺陷，而是功能。
在高效ATP酶中，這個(gè)關(guān)鍵的裂解水通常與ATP的γ-磷酸保持約3.0-3.5埃的理想距離，并且接近180度的直線攻擊角，這種幾何構(gòu)型能夠確保水分子對(duì)磷酸鍵發(fā)起高效的親核攻擊。然而，在RUVBL2中，這個(gè)水分子被推離了至少5.5埃的距離，且攻擊角度偏離了最佳值約50度。這種看似微小的結(jié)構(gòu)差異，對(duì)反應(yīng)速率產(chǎn)生了指數(shù)級(jí)的影響。
早在五年前，張二荃就得到了RUVBL2分子的結(jié)構(gòu)圖，但是起初并不知道該如何理解。直到一次大會(huì)上和KaiC發(fā)現(xiàn)者交流，兩人同時(shí)拿出兩張結(jié)構(gòu)圖，水分子的位置迅速成了他們關(guān)注的焦點(diǎn)。有了這次“點(diǎn)撥”，他們開始修改RUVBL1中的關(guān)鍵天冬氨酸殘基（D353），這臺(tái)緩慢的分子馬達(dá)幾乎完全停止了運(yùn)轉(zhuǎn)；而修改附近的對(duì)照殘基（D356）則對(duì)酶活性毫無影響。
通過修改特定氨基酸來調(diào)整生物鐘的周期，這不乏讓人浮想聯(lián)翩。人的身體里不光存在著24小時(shí)的生物鐘，還有別的時(shí)針級(jí)、分針級(jí)、秒針級(jí)的時(shí)間感應(yīng)，甚至非節(jié)律的生物鐘。如果我們能挖掘操控周期的奧秘，這對(duì)于應(yīng)對(duì)神經(jīng)性疾病至關(guān)重要，例如雙相情感障礙、季節(jié)性情感障礙等。了解人體的時(shí)鐘如何運(yùn)作也能帶來新的想法，比如在一天中對(duì)身體影響最大的時(shí)間服用藥物。在這個(gè)方向，張二荃實(shí)驗(yàn)室已布局多年，通過和神經(jīng)生物學(xué)家合作各取所需，一個(gè)關(guān)注腦區(qū)和神經(jīng)元編碼，一個(gè)關(guān)注分子。
而接下來，張二荃認(rèn)為最為緊迫的事是找到RUVBL2的兩個(gè)兄弟，就像KaiC之于KaiA和KaiB，有了它們的輔助，在體外重建完整的24小時(shí)周期的振蕩。到那個(gè)時(shí)候，教科書將得以真正的改寫：RUVBL系統(tǒng)是生物鐘的起源。
采訪的最后，張二荃提到了他科研路上的英雄楷模——KaiC領(lǐng)域的開拓者近藤先生。在近藤先生的科研生涯中，他的研究對(duì)象從早期的衣藻轉(zhuǎn)移到大腸桿菌、酵母等，最終才鎖定到KaiABC系統(tǒng)的主角藍(lán)藻身上。雖然近藤先生在此領(lǐng)域從無到有地建立了KaiABC系統(tǒng)節(jié)律的檢測(cè)方法，并闡明了其精妙的分子機(jī)制，為該領(lǐng)域的后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但他始終低調(diào)做事，專注于科學(xué)問題本身，不去追求各種名利光環(huán)：他一生只獲得過為數(shù)不多幾項(xiàng)大獎(jiǎng)，比如2007年的日本政府紫綬勛章（排在他之前的是因發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞而獲諾貝爾獎(jiǎng)的中山伸彌）、2014年的日本學(xué)士院獎(jiǎng)（排在他之后的是因睡眠機(jī)制研究而被公認(rèn)將會(huì)獲諾獎(jiǎng)的柳澤正史）。在近藤先生之后，有多達(dá)十幾篇關(guān)于KaiABC的文章爆發(fā)性地發(fā)表在《自然》、《細(xì)胞》、《科學(xué)》這三大期刊上，而他本人作為領(lǐng)域的開拓者，并沒有被所謂的影響因子沖昏頭腦，而是繼續(xù)堅(jiān)持自己小而美的研究，踏實(shí)地做著精細(xì)但并不轟動(dòng)的工作——直至走到生命的盡頭。
