復(fù)旦大學(xué)最新研究揭示：舞蹈癥致病蛋白毒性可能從哪里來？
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撰文｜越君
責(zé)編｜李娟
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還記得幾年前火遍全球社交網(wǎng)絡(luò)的“冰桶挑戰(zhàn)”嗎？那次活動讓人們了解到一種神經(jīng)病變，即“漸凍人癥”。與廣為人知的老年癡呆癥和帕金森病一樣，這類疾病都屬于神經(jīng)退行性疾病（Neurodegenerative Disorders），是由于大腦和脊髓中的神經(jīng)細胞功能衰退所致。因為人體的所有運動，包括說話、吞咽以及呼吸肌的活動等，都是由運動神經(jīng)細胞支配，一旦神經(jīng)細胞失去正常功能，帶來的就是這類足以讓人崩潰的疾病。
舞蹈癥的獨特之處
在神經(jīng)退行性疾病中，還有一種疾病格外引起科學(xué)家的注意——亨廷頓病（Huntingtin Disease），又稱舞蹈癥，因發(fā)病者肢體像跳舞般不受控運動而得名。亨廷頓病與其他同類疾病有個共同點，都是由致病蛋白質(zhì)在神經(jīng)細胞里的異常積累所引起。比如，亨廷頓病的致病蛋白是由變異HTT基因編碼的HTT蛋白。該疾病之所以讓很多科學(xué)家頗感興趣，還因為亨廷頓病還有其獨特之處。
首先，亨廷頓病是遺傳病，單一基因HTT的突變就足以引發(fā)該病。這種單基因遺傳的性質(zhì)有利于對其致病機理的探索，基于此，科學(xué)家建立了相對可靠的疾病遺傳學(xué)模型，進而嚴密地證明了HTT致病蛋白積累與該病的因果關(guān)聯(lián)。
其次，致病基因HTT的突變很特別。與單個核苷酸突變引起的遺傳病不同，HTT基因突變是一段三核苷酸重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)改變。具體來說，該基因有一段CAG重復(fù)序列，正常人中CAG的數(shù)目小于36個，而大于等于36個就會導(dǎo)致疾病。CAG序列編碼的氨基酸是谷氨酰胺(Glutamine)，簡寫是Q，因此CAG重復(fù)序列對應(yīng)的氨基酸是QQQ…Q,常用polyQ來表示。亨廷頓病人的polyQ過長，大多數(shù)病人有40多個重復(fù)，使得HTT蛋白成了導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡以及發(fā)病的“毒蛋白”[1]。
這里有一個非常重要又有趣的問題，HTT蛋白本來不具有毒性，甚至是胚胎發(fā)育所必須的蛋白[2]，為什么該蛋白的polyQ長度超過一定閾值就產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致如此嚴重的疾病呢？
毒性從哪里來
科學(xué)家提出了兩個模型嘗試對此問題作出解釋。
第一個模型被稱為線性格柵模型（Linear Lattice Model）。科學(xué)家認為，polyQ長鏈好似鋪有整齊枕木的鐵軌，由相同的結(jié)構(gòu)單元組成，“枕木”之間的結(jié)構(gòu)單元可能本身就自帶毒性（intrinsictoxicity），polyQ越長，蛋白的細胞毒性越強，達到一定程度就會造成疾病。簡單來說，即polyQ中具有線性排列的含有內(nèi)在毒性的結(jié)構(gòu)單元。
有哪些證據(jù)支持該模型呢？首先，體外生化實驗和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，polyQ的抗體可以與很短的polyQ片段（10Q）結(jié)合[3,4]，而不同polyQ抗體與野生型短polyQ以及突變型長polyQ的結(jié)合模式相同[3,4]。這提示polyQ長鏈是由相同的結(jié)構(gòu)單元組成。其次，有關(guān)蛋白功能的研究顯示，病人的發(fā)病年齡與polyQ長度有關(guān)，polyQ越長，病人的發(fā)病年齡總體來說越早[1]。另有研究表明，如果把小鼠Htt基因的7個CAG重復(fù)完全刪除，小鼠不但沒有出現(xiàn)缺陷，反而延緩了衰老，變得更健康了[5]。
然而，該模型仍然很難解釋為何增長的polyQ會突然產(chǎn)生嚴重毒性，較短的polyQ卻完全正常。而且，相關(guān)體外實驗也無法反映細胞中的情況，因為細胞內(nèi)的polyQ可能具有多種不同構(gòu)象。
于是，有科學(xué)家提出了第二個可能的解釋——毒性浮現(xiàn)構(gòu)象模型（Emergent Conformation），即變異蛋白的polyQ長度達到一定閾值之后，會出現(xiàn)與“整齊的枕木”不同的新的構(gòu)象單元，而這種新的構(gòu)象單元是導(dǎo)致神經(jīng)毒性的主要原因。這種解釋并沒有否定線性格柵模型，只是推測除了線性格柵構(gòu)象之外，polyQ長鏈上還出現(xiàn)了真正具有毒性的“浮現(xiàn)構(gòu)象”，因此是多種構(gòu)象的混合（圖1，摘自參考文獻[6]）。
?圖1 解釋變異毒性蛋白HTT中polyQ長鏈構(gòu)象的線性格柵模型（Linear lattice）與毒性構(gòu)象浮現(xiàn)模型(Emergent conformation)。[6]
毒性浮現(xiàn)模型的支持證據(jù)相對來說非常間接，主要是基于不同polyQ抗體識別的變異HTT蛋白信號與細胞毒性的相關(guān)性不同，因此推測變異HTT蛋白過長的polyQ具有多種構(gòu)象，其中包括了最具毒性的“浮現(xiàn)構(gòu)象”[6]。這里相關(guān)性的計算基于很多非直觀的假設(shè)，缺乏更直接的證據(jù)，被不少研究反對[4,7]。
由此可以看出，以上兩種觀點最大的爭議在于，變異蛋白中過長的polyQ是否存在多種不同的構(gòu)象，也就是構(gòu)象是否存在“多態(tài)性”。
這可能是生物化學(xué)的一個根本問題。因為我們知道，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)由該蛋白質(zhì)的氨基酸序列所決定，這被稱為Anfinsen法則（Anfinsen’s Dogma），并獲得1972年的諾貝爾獎。該法則也是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基礎(chǔ)，因為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究基于這樣的假設(shè)：蛋白質(zhì)在特定體外條件下的三維結(jié)構(gòu)與細胞內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)相同。
然而，有不少蛋白會“錯誤折疊”（misfolding）并產(chǎn)生不同的構(gòu)象。在神經(jīng)退行性疾病中，“錯誤折疊”的蛋白容易聚集在一起并最終形成蛋白沉淀。那么，可溶性蛋白質(zhì)的單體是否也會違背Anfinsen法則，通過“錯誤折疊”產(chǎn)生多種不同的構(gòu)象，進而產(chǎn)生不同的毒性，最終導(dǎo)致疾病呢？目前還沒有答案。而且，如果真的存在“多態(tài)性”，為什么其中某些構(gòu)象的毒性會更高？這也是關(guān)于疾病致病機制的根本性問題。
但是研究上述問題很難。變異HTT蛋白非常大（>300kDa），結(jié)構(gòu)難于解析。即使可以解析，目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段無法在細胞非變性條件下解析特定目標蛋白的精細結(jié)構(gòu)，而體外純化的條件下則可能無法獲得蛋白折疊的各種構(gòu)象，更加無法進一步證明各種構(gòu)象可能的功能（毒性）差異。
用“蛋白質(zhì)降解”來探尋答案
2017年9月4日，Nature Chemical Biology在線發(fā)表了一篇論文[8]，由復(fù)旦大學(xué)魯伯塤課題組完成，該論文從一個嶄新的角度研究上述問題：蛋白質(zhì)降解。
細胞中，新蛋白質(zhì)在不斷地合成，完成功能的或者“錯誤折疊”的蛋白質(zhì)則被不斷地降解，生成小的肽段或氨基酸。主要有兩個可能的因素影響蛋白降解速率：蛋白構(gòu)象和蛋白功能。
一方面，蛋白構(gòu)象很可能影響其降解速率，如果同類細胞的同一蛋白有著不同的降解速率，意味著該蛋白存在不同的構(gòu)象；另一方面，蛋白降解是蛋白功能的終極調(diào)控。已有數(shù)據(jù)表明，疾病蛋白的降解速率與其神經(jīng)毒性呈非常顯著的負相關(guān)，即致病蛋白降解越慢，其毒性越大[9]。因此，了解蛋白本身是否具有構(gòu)象的“多態(tài)性”，以及不同構(gòu)象蛋白的毒性是否具有“多態(tài)性”，都可以從研究蛋白的降解速率入手。如果不同polyQ抗體識別的HTT蛋白的降解速率不同，則證明的確存在不同構(gòu)象，而且降解速率較慢的構(gòu)象的毒性可能較大。
為了檢測以上假說，魯伯塤課題組測得了同一組樣品中被不同polyQ抗體（主要有MW1和3B5H10兩種）所識別的HTT蛋白的降解速率。他們所使用的測量方法被稱為CH-chase，是基于點擊化學(xué)（Click Chemistry）和均相時間分辨熒光（HTRF）技術(shù)而建立的。
首先，他們選用的細胞模型是病人的真皮成纖維細胞，這是因為該細胞中有全長的變異HTT蛋白，并且檢測不到寡聚體或多聚體，排除了可能的干擾因素，進而只檢測可溶性HTT蛋白單體的降解。研究顯示，在三種不同的病人真皮成纖維細胞中，polyQ抗體3B5H10所識別的HTT的降解速率顯著低于另一種polyQ抗體（MW1）所識別的HTT的降解速率，從而直接證明了不同polyQ構(gòu)象的存在。這種降解速率差異在過表達的體系中一樣可以被檢測到。有趣的是，這種差異只在過長的polyQ（46Q，72Q，100Q）中存在，在野生型長度的polyQ（18Q及23Q）中并沒有檢測到，從而證明了過長的polyQ出現(xiàn)了“浮現(xiàn)構(gòu)象”，因此產(chǎn)生了“多態(tài)性”。
那么，是什么因素減慢了這類HTT蛋白的降解速率呢？魯伯塤課題組的進一步研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致3B5H10抗體所識別的HTT蛋白的降解顯著變慢的原因，是因為其能夠抵抗自噬作用。
自噬（Autophagy）是細胞清除蛋白的重要手段，自噬小泡包裹住蛋白，并將其運送至溶酶體完成降解。自噬分子機制的發(fā)現(xiàn)獲得了2016年的諾貝爾獎。傳統(tǒng)觀點認為，自噬作用是非選擇性地，能隨機清除任何蛋白。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，有些自噬過程中，自噬小泡會利用自噬受體蛋白p62或NBR1等有選擇性地吞噬特定的蛋白，這個過程稱為選擇性自噬。
魯伯塤課題組的研究發(fā)現(xiàn)，在病人細胞、小鼠大腦組織乃至病人大腦組織中，變異HTT蛋白的賴氨酸63型泛素化幾乎缺失，因此無法被選擇性自噬受體蛋白p62所識別，也就無法被選擇性自噬降解。這就解釋了為何這種HTT構(gòu)象降解速度顯著變慢（圖2）。
?圖2 亨廷頓致病蛋白HTT的polyQ長鏈有多種構(gòu)象，其中具有毒性的構(gòu)象蛋白比野生型蛋白降解得要慢，因為它無法被自噬小泡包裹而進行快速降解，這也可能是其產(chǎn)生更高神經(jīng)毒性的原因。
這項最新研究揭示了導(dǎo)致亨廷頓疾病的變異蛋白HTT的polyQ長鏈存在多種不同的構(gòu)象，并因此導(dǎo)致了不同的降解速率，產(chǎn)生了不同的毒性。這種“多態(tài)性”可能補充了對“Anfinsen法則”的認識。同時，該研究進一步明確了選擇性自噬作用的機制，發(fā)現(xiàn)選擇性自噬比之前認為的要更具選擇性：它不僅能識別特定的蛋白進行降解，甚至能識別同一蛋白的不同構(gòu)象。
該研究在疾病研究領(lǐng)域也有重要意義，不僅刷新了科學(xué)家對疾病機制的認識，而且提供了治療疾病的新思路。例如，可尋找化合物迫使疾病蛋白從慢速降解的構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖俳到獾臉?gòu)象，達到治療疾病的目的。不過，仍然有幾個關(guān)鍵問題亟待解答，比如，為何polyQ構(gòu)象的改變會影響HTT的泛素化以及選擇性自噬的識別，其他polyQ蛋白是否具有類似的性質(zhì)等，值得后續(xù)研究。
參考文獻
1.Walker, F.O., Huntington's disease. Lancet, 2007. 369(9557): p. 218-28.
2.Nasir, J., et al., Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell, 1995. 81(5): p. 811-23.
3.Li, P., et al., The structure of a polyQ-anti-polyQ complex reveals binding according to a linear lattice model. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(5): p. 381-7.
4.Klein, F.A., et al., Linear and extended: a common polyglutamine conformation recognized by the three antibodies MW1, 1C2 and 3B5H10. Hum Mol Genet, 2013. 22(20): p. 4215-23.
5.Zheng, S., et al., Deletion of the huntingtin polyglutamine stretch enhances neuronal autophagy and longevity in mice. PLoS Genet, 2010. 6(2): p. e1000838.
6.Miller, J., et al., Identifying polyglutamine protein species in situ that best predict neurodegeneration. Nat Chem Biol, 2011. 7(12): p. 925-34.
7.Owens, G.E., et al., Anti-PolyQ Antibodies Recognize a Short PolyQ Stretch in Both Normal and Mutant Huntingtin Exon 1. J Mol Biol, 2015. 427(15): p. 2507-19.
8.Fu, Y.W., P. Pan, Y. Sun, X, Yang, H. Difiglia, M. Lu, B., A toxic mutant huntingtin species is resistant to selective autophagy. Nature Chemical Biology, 2017.
9.Tsvetkov, A.S., et al., Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nat Chem Biol, 2013. 9(9): p. 586-92.
制版編輯： 許逸｜
