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合成生物學(xué)設(shè)計(jì)的目的之一是通過(guò)合成線路的理性設(shè)計(jì)賦予細(xì)胞新的功能。不過(guò)目前整個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展主要聚焦在基因?qū)哟蔚恼{(diào)控設(shè)計(jì)。然而，自然細(xì)胞的諸多功能并不全部通過(guò)基因?qū)哟蔚恼{(diào)控實(shí)現(xiàn)，蛋白質(zhì)層次的相互作用是另一種主要的調(diào)控方式。細(xì)胞利用蛋白之間的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)特定的蛋白質(zhì)本身的活性、定位以及穩(wěn)定性等諸多參數(shù)的調(diào)控。比如，Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程即是蛋白質(zhì)水平調(diào)控的案例之一：蛋白酶之間通過(guò)切割過(guò)程彼此激活，啟動(dòng)下游信號(hào)的反應(yīng)。

而合成蛋白線路相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控線路具有更多的優(yōu)勢(shì)，比如更加快速的調(diào)控過(guò)程、與內(nèi)源信號(hào)通路更加直接的偶聯(lián)、可以直接將蛋白酶RNA轉(zhuǎn)錄本遞送進(jìn)目的細(xì)胞，無(wú)需將基因整合進(jìn)目的細(xì)胞基因組之中。

蛋白質(zhì)水平的合成生物學(xué)線路可以幫助我們工程化改造和設(shè)計(jì)更加強(qiáng)大的細(xì)胞行為。可組合的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)將促進(jìn)理性的蛋白質(zhì)線路設(shè)計(jì)，其中各個(gè)蛋白質(zhì)組分通過(guò)相互調(diào)控可以產(chǎn)生多樣化的線路結(jié)構(gòu)。

在這項(xiàng)研究中，研究人員展示了工程化的病毒蛋白酶可以作為可組合的蛋白質(zhì)組分發(fā)揮作用。這種組合可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)多種功能。該系統(tǒng)中被稱(chēng)為CHOMP（circuits of hacked orthogonal modular proteases，分裂的正交化-模塊化蛋白酶線路），其中作為輸入信號(hào)的蛋白酶可以與靶蛋白酶實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的對(duì)接并切割靶蛋白酶，從而以抑制靶蛋白酶的功能。通過(guò)組合這些元件，研究人員展示了這些組合可以生成級(jí)聯(lián)調(diào)控、二進(jìn)制邏輯門(mén)和動(dòng)態(tài)模擬信號(hào)處理功能。

二進(jìn)制邏輯門(mén)：OR、AND、NOR、NAND、IMPLY、NIMPLY、XOR、XNOR

Bandpass circuit & Adaptive pulse ciruit

為了證明該系統(tǒng)的實(shí)用性，研究人員理性地設(shè)計(jì)了一種合成線路，該線路可以響應(yīng)Ras致癌基因的上游激活因子而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。CHOMP線路可以執(zhí)行復(fù)雜功能，同時(shí)可以編碼為單個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并且無(wú)需基因組整合即可整合進(jìn)細(xì)胞之中，這將有力的促進(jìn)蛋白線路在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

Ras-conditional Caspase-3 circuit

現(xiàn)代計(jì)算機(jī)計(jì)算過(guò)程主要基于時(shí)序邏輯，其中電路的狀態(tài)取決于當(dāng)前輸入信號(hào)以及過(guò)去的輸入信號(hào)（記憶）。將時(shí)序邏輯植入活細(xì)胞可以使其通過(guò)離散狀態(tài)執(zhí)行相應(yīng)的生物過(guò)程。例如，利用時(shí)序邏輯可以使細(xì)胞分化成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者令生物材料的組裝過(guò)程按照一定順序進(jìn)行。然而，時(shí)序邏輯的設(shè)計(jì)存在著重大的挑戰(zhàn)，即時(shí)序邏輯的實(shí)現(xiàn)需要在基因線路中植入反饋調(diào)控，但反饋調(diào)控不僅難以設(shè)計(jì)同時(shí)很難擴(kuò)大規(guī)模。

在這篇文章中研究人員提出了一種用于設(shè)計(jì)時(shí)序邏輯基因線路的定量方法。 此方法使用“NOT”邏輯門(mén)作為調(diào)控的核心單位【“NOT”邏輯：輸入啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)阻遏蛋白的表達(dá)，而阻遏蛋白酶用于關(guān)閉輸出啟動(dòng)子】。 通過(guò)測(cè)定其響應(yīng)函數(shù)（response function，改變輸入如何影響穩(wěn)態(tài)下的輸出），研究人員對(duì)每種NOT邏輯門(mén)進(jìn)行了詳細(xì)的表征。 同時(shí)，響應(yīng)函數(shù)被視為Nullclines，來(lái)自非線性動(dòng)力學(xué)（相平面和分叉分析）的工具用來(lái)預(yù)測(cè)不同邏輯門(mén)的組合如何對(duì)穩(wěn)態(tài)和動(dòng)力學(xué)行為產(chǎn)生影響。 

The response functions are treated as nullclines, and tools from nonlinear dynamics (phase plane and bifurcation analyses) are applied to predict how combining gates leads to multiple steady states and dynamics.

這項(xiàng)工作中，研究人員將時(shí)序邏輯應(yīng)用于細(xì)胞檢查點(diǎn)（checkpoint ）的控制，其中只有正確的信號(hào)出現(xiàn)后，細(xì)胞才會(huì)轉(zhuǎn)向下一狀態(tài)。 研究設(shè)計(jì)的基因線路可以指導(dǎo)大腸桿菌進(jìn)行線性或循環(huán)的狀態(tài)切換。

Sequential logic for checkpoint control

這項(xiàng)工作根據(jù)簡(jiǎn)單的規(guī)則，通過(guò)組合可靠的調(diào)控邏輯，向我們展示了在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)時(shí)序邏輯線路的定量方法。 這種方法有利于相應(yīng)自動(dòng)化軟件的設(shè)計(jì)，同時(shí)自動(dòng)化軟件可以利用這些規(guī)則來(lái)構(gòu)建規(guī)模更大的由不同邏輯門(mén)組合線路。 這為建立具有反饋回路的調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)提供了一種可行的設(shè)計(jì)途徑。反饋回路這對(duì)許多細(xì)胞功能至關(guān)重要，并且在自然網(wǎng)絡(luò)中無(wú)處不在。 這項(xiàng)工作代表著我們向在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行高級(jí)計(jì)算邁出了關(guān)鍵的一步。

這篇文章向我們展示Christopher Voigt實(shí)驗(yàn)室強(qiáng)大的復(fù)雜基因線路設(shè)計(jì)功力，文章的深度和復(fù)雜性也讓讀者有點(diǎn)望而卻步。難怪帝國(guó)理工大學(xué)的合成生物學(xué)學(xué)者Tom Ellis Twitter發(fā)文稱(chēng)：“Synthetic biology is getting pretty complex. Trying to wrap my head around these diagrams in the latest logic-based tour de force from the Voigt lab.”

《Science》同期刊發(fā)了David S. Glass和Uri Alon對(duì)兩篇合成生物學(xué)文章的評(píng)論文章，其中重點(diǎn)談及了“可組合性”對(duì)于合成生物學(xué)的重要性。

以下是對(duì)此篇文章的翻譯，并對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了部分增添和修改。

合成生物學(xué)領(lǐng)域目的之一便是設(shè)計(jì)用于編程細(xì)胞和組織的遺傳線路。這些線路將使細(xì)胞能夠檢測(cè)疾病并采取行動(dòng)對(duì)其進(jìn)行補(bǔ)救；指導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生有用的物質(zhì)和材料；甚至允許細(xì)胞自組裝成新的、用戶定義的組織結(jié)構(gòu)[1]。隨著合成生物學(xué)元件庫(kù)的逐漸增加，細(xì)胞中的基因線路從包含幾個(gè)元件的線路開(kāi)始[2, 3]逐漸發(fā)展成為越來(lái)越大且復(fù)雜的線路。但這些基因線路的復(fù)雜性和規(guī)模卻一直是有限的，其中設(shè)計(jì)大型合成生物學(xué)系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)便是【可組合性（Composability）】：連接任意元件并實(shí)現(xiàn)可預(yù)測(cè)行為的能力。在本期《Science》，Gao 等人[5]描述了一種基于蛋白酶的可組合的合成生物學(xué)系統(tǒng)；Andrews 等人[6]描述了一種具有多種狀態(tài)的時(shí)序邏輯系統(tǒng)。最近，Toda 等人[7]使用合成細(xì)胞細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞的分化和粘附使其形成了多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這些研究表明，對(duì)“可組合性”的研究可以使合成生物學(xué)超越傳統(tǒng)的限制，進(jìn)一步拓展到更大的發(fā)展空間之中。

可組合性是一個(gè)相對(duì)微妙的概念，其中重要的是要記住幾個(gè)相關(guān)但不同的概念。合成生物學(xué)中的正交性（Orthogonality）指不會(huì)干擾或彼此干擾最小化的元件。這相當(dāng)于元件之間缺乏串?dāng)_。例如，如果兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子不調(diào)節(jié)彼此的啟動(dòng)子，則它們是正交的。模塊化（Modularity）是指可以劃分為子系統(tǒng)的系統(tǒng)，每個(gè)子系統(tǒng)都具有定義明確的功能。這些概念適用于蛋白質(zhì)分子、轉(zhuǎn)錄基因線路和多細(xì)胞系統(tǒng)等多個(gè)層面。

可組合性是比正交性或模塊性更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。可組合的元件是具有匹配輸入和輸出的模塊化單元，任何兩個(gè)元件可以相互連接并產(chǎn)生可預(yù)測(cè)的行為。元件及其接口的標(biāo)準(zhǔn)化是開(kāi)發(fā)這種“即插即用（plug-and-play）”功能的一種方式。與生物線路相比，即使是通常被認(rèn)為易于設(shè)計(jì)的電子電路也不一定是可組合的，如果輸入和輸出阻抗設(shè)計(jì)不合適，組合的電子元件也可能會(huì)失敗; 生物線路中的類(lèi)似概念被稱(chēng)為追溯效力（Retroactivity，指信號(hào)通路下游的系統(tǒng)給上游系統(tǒng)帶來(lái)信號(hào)反饋，從而影響上游系統(tǒng)功能的效應(yīng)）。自然系統(tǒng)也具有大致上的模塊性和正交性，但是仍無(wú)法滿足合成生物學(xué)對(duì)元件的工程化要求。因此，合成生物學(xué)家必須仔細(xì)地改造自然元件來(lái)獲取可組合性。

合成生物學(xué)的一個(gè)重要目標(biāo)是將基因調(diào)控水平的線路設(shè)計(jì)（由于蛋白產(chǎn)生的緩慢時(shí)間，調(diào)控為小時(shí)級(jí)別）轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)控線路，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用可以在幾秒到幾分鐘內(nèi)發(fā)生。蛋白線路不僅速度更快，而且還提供強(qiáng)大的功能，包括直接與細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)偶聯(lián)、在不同的亞細(xì)胞位點(diǎn)執(zhí)行功能。但是目前蛋白線路的主要問(wèn)題在于缺乏可組合、可預(yù)測(cè)的調(diào)控蛋白工具包。

Gao等人使用稱(chēng)為病毒蛋白酶的分子剪刀解決了這個(gè)問(wèn)題。利用結(jié)合結(jié)構(gòu)域、降解標(biāo)簽和正交化切割位點(diǎn)，他們?cè)O(shè)計(jì)這些蛋白酶以可編程的方式特異性地進(jìn)行彼此之間的相互調(diào)控。

由于蛋白酶相關(guān)模塊之間的可組合性，研究人員設(shè)計(jì)了基于蛋白酶相互作用的雙輸入布爾邏輯門(mén)。研究人員還設(shè)計(jì)了更復(fù)雜的線路，包括脈沖發(fā)生器（pulse generator）。他們甚至使用蛋白線路選擇性地殺死攜帶驅(qū)動(dòng)癌癥發(fā)生的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。所有這些都發(fā)生蛋白質(zhì)水平，并且全部編碼在單個(gè)RNA分子上。這種能力擴(kuò)大了使用合成線路作為治療方案的可能性，因?yàn)榈鞍拙€路能夠通過(guò)RNA遞送進(jìn)細(xì)胞之中，同時(shí)不需要對(duì)基因組進(jìn)行任何編輯。

合成生物學(xué)的另一個(gè)目標(biāo)是設(shè)計(jì)時(shí)序邏輯線路。基于可組合的轉(zhuǎn)錄因子，Andrews 等設(shè)計(jì)了具有可逆狀態(tài)的時(shí)序邏輯線路。這種發(fā)展依賴于對(duì)置位—復(fù)位鎖存器（set-reset latches）庫(kù)的詳細(xì)表征，每個(gè)鎖存器由調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子組成，受到其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)并能夠調(diào)節(jié)其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。研究人員將這些鎖存器與邏輯線路組合成可以記住多個(gè)事件的狀態(tài)機(jī)（稱(chēng)為數(shù)據(jù)鎖存器）。這種鎖存器可以被設(shè)置不同的狀態(tài)，同時(shí)也可以鎖定在某一狀態(tài)，以及其可以在不同化學(xué)信號(hào)控制下在多個(gè)狀態(tài)之間進(jìn)行循環(huán)切換。這些線路設(shè)計(jì)可用于環(huán)境信號(hào)的檢測(cè)，例如，在細(xì)胞響應(yīng)信號(hào)合適之前必須發(fā)生的一系列和檢查點(diǎn)相關(guān)的“Go or No-Go”事件。

可組合性也可以應(yīng)用于多細(xì)胞水平，將單個(gè)細(xì)胞視為可組合單元，不同細(xì)胞以可預(yù)測(cè)的方式彼此交互。合成多細(xì)胞系統(tǒng)有望幫助組織再生和產(chǎn)生能夠響應(yīng)環(huán)境的結(jié)構(gòu)化生物材料。這些能力的關(guān)鍵是細(xì)胞—細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞分化和細(xì)胞粘附系統(tǒng)。研究人員已經(jīng)使用合成信號(hào)傳導(dǎo)和分化（或記憶）上實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞的模式形成。最近，可組合細(xì)胞膠聯(lián)（粘附素）系統(tǒng)被用于從生物物理層次編程細(xì)菌中的細(xì)胞—細(xì)胞相互作用，這使得在單個(gè)細(xì)胞的尺度范圍內(nèi)細(xì)胞自組裝成三維（3D）模式成為可能。

Toda 等人通過(guò)可組合的一組分子“鎖”和“鑰匙”（合成的鄰分泌信號(hào)傳導(dǎo)）對(duì)組織進(jìn)行編程使其分化成為多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。相鄰細(xì)胞可以相互激活粘附分子的表達(dá)，并分化成新的細(xì)胞類(lèi)型。此系統(tǒng)的時(shí)序步驟通過(guò)基于粘附的細(xì)胞分選過(guò)程實(shí)現(xiàn)自驅(qū)動(dòng)（見(jiàn)下面視頻）。此處的細(xì)胞分選是一種生物物理過(guò)程，其使細(xì)胞直接接觸從而促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)此種方式得到的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)讓人聯(lián)想到胚胎發(fā)育過(guò)程，兩者具有相似的行為，例如對(duì)稱(chēng)性破壞和損傷后的再生。通過(guò)合成信號(hào)調(diào)控粘附過(guò)程使得該過(guò)程比純粘附結(jié)構(gòu)更加可控和通用化，開(kāi)辟了人工開(kāi)發(fā)系統(tǒng)研究體外發(fā)育的研究道路。

在未來(lái)，特別是當(dāng)集成不同調(diào)控水平的線路組成更強(qiáng)大的系統(tǒng)時(shí)，可組合性可能會(huì)扮演著重要的角色?；谥貙?xiě)或切除DNA的記憶過(guò)程，如果運(yùn)用靈活的時(shí)序邏輯調(diào)控實(shí)現(xiàn)，我們不僅可以設(shè)計(jì)具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性、規(guī)模更大狀態(tài)機(jī)，同時(shí)也就不再需要活躍的蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)程來(lái)維持記憶?；诘鞍踪|(zhì)的線路結(jié)合轉(zhuǎn)錄邏輯可以在多個(gè)時(shí)間尺度上協(xié)調(diào)合成生物學(xué)調(diào)控過(guò)程。在多細(xì)胞環(huán)境中，將信號(hào)傳導(dǎo)和粘附過(guò)程耦合時(shí)序邏輯可以使可設(shè)計(jì)的發(fā)育調(diào)控程序規(guī)模更大化。雖然這些整合性的合成生物學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在自然界中均可以找到對(duì)應(yīng)物（例如，動(dòng)物發(fā)育和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)），但是合成線路可以更好的闡明原生系統(tǒng)：人們可以通過(guò)在真實(shí)的生物環(huán)境中構(gòu)建線路來(lái)測(cè)試計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)果，而這種過(guò)程并不會(huì)像那研究原生系統(tǒng)那樣充滿未知因素。隨著通過(guò)時(shí)序邏輯、蛋白線路和多細(xì)胞系統(tǒng)的可組合工具包解決掉合成生物學(xué)長(zhǎng)期以來(lái)的部分限制因素，生物醫(yī)學(xué)的工程化設(shè)計(jì)和“Build to understand”的未來(lái)是光明的。

注：本文來(lái)自微信公眾號(hào)“再創(chuàng)”