生物多樣性：免疫球蛋白 | 饒毅講課
撰文 | 饒毅
多樣性與自然選擇是生物演化的核心規(guī)律。
多樣性與選擇也是免疫學(xué)的核心概念之一。
免疫學(xué)的發(fā)展，不僅帶來了對(duì)基本原理的理解，在分子水平揭示了美妙的自然規(guī)律，而且建立了對(duì)生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)實(shí)踐有用的技術(shù)，改善了人類的健康、推動(dòng)了人類的進(jìn)步。
免疫與危害動(dòng)植物的感染密切相關(guān)。動(dòng)植物識(shí)別和排除抗原性異物，應(yīng)對(duì)外界病原菌、污染物和體內(nèi)疾病等，參與監(jiān)控清除自身變異成分（腫瘤、衰老和死亡細(xì)胞）。免疫分為先天性免疫和獲得性免疫。先天性免疫又稱非特異性免疫（innate immunity或nonspecific immunity）是在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成，并具有遺傳特性，生來具有的功能免疫；獲得性免疫又稱特異性免疫（acquired immunity or specific immunity），是后天感染抗原性異物，或人工接種物（如疫苗和異物等）而使機(jī)體獲得，針對(duì)病原體的抵抗能力。哺乳類動(dòng)物中有特異的淋巴細(xì)胞分別介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原相對(duì)應(yīng)的抗體，來達(dá)到保護(hù)生物體的免疫機(jī)制。面對(duì)自然界如此繁多的抗原性物質(zhì)，個(gè)體生物可以產(chǎn)生直接與抗原結(jié)合，多于1011種類的蛋白抗體分子，被稱之為抗體的多樣性。
免疫學(xué)研究源于人類希望抵抗傳染病，也與人類對(duì)輸血的實(shí)際需求有關(guān)。經(jīng)過迷信、迷惑、試錯(cuò)等多個(gè)階段，步履艱難、甚至犯過錯(cuò)誤，堅(jiān)持探索的嚴(yán)肅研究者逐漸從現(xiàn)象到本質(zhì)，到1898年確定：抵抗傳染病和輸血涉及相同的核心問題——免疫。對(duì)免疫的機(jī)理，從1900年誕生側(cè)鏈學(xué)說后不斷修改，1957年出現(xiàn)克隆選擇學(xué)說，1960年代理解抗體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，1970年代理解編碼抗體的DNA有特殊的重組機(jī)制逐步解析抗體多樣性產(chǎn)生的機(jī)理。
天花的預(yù)防
在兩千五百年前，古希臘歷史學(xué)家Thucydides（460-400 BC）記錄了雅典的傳染病，患病痊愈者一般不再發(fā)病、如果發(fā)病也輕于初發(fā)者。基督教曾把這種差別歸因于上帝，把第一次就不生病者（我們今天知道是天然免疫者）認(rèn)為是無罪者，而患病痊愈者（后天免疫者）當(dāng)成洗清了罪惡。在歐洲所謂中世紀(jì)的階段，阿拉伯世界和伊斯蘭地區(qū)的科學(xué)發(fā)展，改變了人類對(duì)傳染病和免疫的宗教和迷信看法。
天花（variola, small pox）可能有上萬年的歷史（Riedel，2005）：在公元前一千年前的埃及木乃伊上留下了天花的痕跡，中國(guó)也在公元前1122年就有天花的記載，歐洲在5世紀(jì)到7世紀(jì)間開始有天花。天花曾肆虐世界，死亡率高、不死也留下失明或臉上疤痕等后遺癥。18世紀(jì)歐洲天花感染率非常高，接近全部群居人口，占兒童死亡率的三分之一。
人們很早知道已患過天花的人不會(huì)再患天花。在世界上多個(gè)地區(qū)曾出現(xiàn)用天花病人的少量液體接種給健康人，使后者獲得免疫力。這一方法也有人告訴歐洲，但未獲推廣。英國(guó)駐奧斯曼帝國(guó)大使蒙太古夫人（Mary Wortley Montague，1689-1762）于1717年在伊斯坦布爾根據(jù)當(dāng)?shù)亓鱾鞯姆椒?，?qǐng)使館醫(yī)生Charles Maitland（1668-1748）監(jiān)督給自己兒子接種少量天花（Downie，1951）。她們回英國(guó)后，她請(qǐng)Maitland再給女兒接種，Maitland要求有六個(gè)醫(yī)生在場(chǎng)。成功后，其中一位醫(yī)生要求給自己的兒子接種。英國(guó)還用犯人和孤兒做過試驗(yàn)，讓皇后放心后，她再要求給王子接種，這樣逐漸傳開。接種少量天花既可能有效，也可能導(dǎo)致天花發(fā)病。
1774年，英國(guó)農(nóng)民Benjamin Jesty（1737-1816）用擠奶女工的牛痘接種于其妻子和兩個(gè)兒子，成功地避免了他們患天花（Pead，2003），但他沒發(fā)表文章。鄉(xiāng)村醫(yī)生Edward Jenner（1749-1823）有相當(dāng)?shù)目茖W(xué)基礎(chǔ)，1787年確定杜鵑的行為而于1789年入選皇家學(xué)會(huì)。1796年5月14日，他從擠奶女工Sarah Nelmes手上取得牛痘接種給8歲的男孩James Phipps（1788-1853），六周后接種少量天花，Phipps完全不被感染，證明牛痘誘導(dǎo)免疫的成功。Jenner并非第一位接種牛痘者，但他第一位正式報(bào)道牛痘接種的方法。1798年，Jenner總結(jié)了自己接種病例以及通過訪問得到的一些回顧性病例，共23例發(fā)表專著（Jenner，1798），1799再加例子，到1801年英國(guó)有逾六百例（Jenner，1801）。Jenner還區(qū)分了真的牛痘和假的牛痘，從假牛痘獲得的材料不能有效地引起對(duì)天花的免疫，真牛痘才能保證成功地誘發(fā)免疫。Jenner稱牛痘為Variolae vaccinae（牛的天花），用牛痘接種導(dǎo)致人對(duì)人的天花免疫就被稱為vaccine。Jenner當(dāng)時(shí)有一個(gè)錯(cuò)誤，認(rèn)為牛的天花來自馬的炎癥，但他對(duì)牛痘接種的方法做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。
免疫學(xué)的發(fā)展與微生物學(xué)相關(guān)。十九世紀(jì)，法國(guó)化學(xué)家巴斯德（Louis Pasteur, 1822-1895）和德國(guó)醫(yī)生科霍（Robert Koch，1843-1910）為代表的科學(xué)家們證明傳染病的病原菌學(xué)說，建立培養(yǎng)細(xì)菌的方法，發(fā)現(xiàn)重要的致病菌，發(fā)明多種傳染病的疫苗（炭疽病和雞霍亂疫苗等）（Pasteur, 1881），推動(dòng)了免疫學(xué)的發(fā)展。巴斯德把原來詞根為牛的vaccine推廣為廣義的疫苗（Baxby，1999）。
接種疫苗后，人獲得免疫力的原理是什么？巴斯德曾認(rèn)為是第一次感染過程中細(xì)菌耗盡了體內(nèi)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)成分，所以細(xì)菌不能再感染同一個(gè)人，該個(gè)體從而產(chǎn)生免疫力。
抗血清的發(fā)現(xiàn)
先天免疫的發(fā)現(xiàn)歸功于俄國(guó)科學(xué)家élie Metchnikoff（1845-1916）在俄國(guó)和法國(guó)進(jìn)行的研究。Metchnikoff最早在其比較病理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞的作用（Metchnikoff，1884，1901,1905; Tauber, 2003）。
體液免疫研究源于德國(guó)。1888年，法國(guó)細(xì)菌學(xué)家Emile Roux（1853-1933）和旅法瑞士細(xì)菌學(xué)家Alexandre Yersin（1863-1943）發(fā)現(xiàn)白喉毒素是白喉?xiàng)U菌致病的原因。1889年Koch實(shí)驗(yàn)室的北里柴三郎（Shibasaburo Kitasato，1853-1931）發(fā)現(xiàn)破傷風(fēng)毒素是破傷風(fēng)桿菌致病的原因。毒素研究風(fēng)靡一時(shí)的情況下， Koch曾誤認(rèn)為結(jié)核菌素（tuberculin）是結(jié)核桿菌治病的原因。
1890年，Koch研究所的Emil Adolf Behring（1854-1917）和北里柴三郎發(fā)表“動(dòng)物對(duì)白喉和破傷風(fēng)免疫的機(jī)理”一文，報(bào)道了白喉毒素的抗毒素和破傷風(fēng)毒素的抗毒素（Behring and Kitasato，1890），證明在不含細(xì)胞的血清中有免疫作用的物質(zhì)。Behring主要做白喉、北里做破傷風(fēng)的抗毒素，他們獲得的抗血清既能治療已感染的動(dòng)物，也能預(yù)防健康動(dòng)物被感染。在Behring和北里之前，除了細(xì)胞免疫之外，免疫的原因認(rèn)為是因?yàn)檠河袣⒕芰?、或?dòng)物適應(yīng)了毒素、或動(dòng)物在接種后發(fā)生了化學(xué)變化使其體液和組織不利于微生物生長(zhǎng)。Behring用大鼠進(jìn)行的白喉研究不支持以上解釋，而提出免疫后動(dòng)物的血液可以中和白喉毒素，這一結(jié)論在北里的破傷風(fēng)毒素研究得到進(jìn)一步支持和推廣。
Behring和北里報(bào)道的破傷風(fēng)實(shí)驗(yàn)既用過破傷風(fēng)桿菌、也用過破傷風(fēng)毒素作為免疫原，用低于導(dǎo)致疾病的劑量注射給兔，誘發(fā)兔的免疫，被注射后的兔對(duì)再感染或破傷風(fēng)毒素有20倍的抵抗力。從有免疫力的兔的頸動(dòng)脈獲取血，注射給小鼠的腹腔，得到的兩只小鼠與未被免疫兔血注射的兩只小鼠比較。后者在破傷風(fēng)桿菌注射后分別于20小時(shí)、36小時(shí)死亡，而免疫兔血注射過的小鼠健康生存。如果免疫的兔血凝結(jié)，其上清也就是血清。以免疫的兔血清注射6只小鼠的腹腔，24小時(shí)后他們?cè)俦黄苽L(fēng)桿菌感染不會(huì)生病，而對(duì)照小鼠48小時(shí)死亡。以上實(shí)驗(yàn)顯示免疫的血清可以讓正常動(dòng)物對(duì)感染的抵抗力增加，有預(yù)防作用。他們還將抗血清與可以感染小鼠的破傷風(fēng)桿菌同時(shí)注射的動(dòng)物，也提高后者的生存。他們認(rèn)為這是治療作用。一旦獲得抗血清，無論預(yù)防式、還是治療式，小鼠長(zhǎng)期免疫。作為對(duì)照，非免疫的兔血清，沒有這些作用。他們不僅用了兔，還用過牛、馬和羊。
Behring和北里的文章清晰地表明血清中含有對(duì)抗毒素的物質(zhì)：破傷風(fēng)免疫后的兔血可以中和破傷風(fēng)毒素；這一作用存在于無細(xì)胞的血清中；將免疫動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)入其他動(dòng)物可以繼續(xù)發(fā)揮作用；未經(jīng)免疫的動(dòng)物不具有消滅破傷風(fēng)毒素的能力（Behring and Kitasato，1890）。這篇文章開創(chuàng)了體液免疫。
一周后在同一刊物，Behring單獨(dú)發(fā)表了有關(guān)動(dòng)物對(duì)白喉免疫力的論文（Behring，1890），補(bǔ)充第一篇文章的破傷風(fēng)毒素。他顯示動(dòng)物的血液也可以產(chǎn)生對(duì)白喉毒素的免疫力。Behring單獨(dú)的這篇文章未用抗血清一詞，不如兩人合作的抗破傷風(fēng)毒素的文章。
當(dāng)時(shí)也在Koch研究所工作的Paul Ehrlich（1854-1919）也研究了抗毒素。Ehrlich發(fā)現(xiàn)了兩種植物蛋白質(zhì)（蓖麻毒素（ricin）和相思子毒素（abrin））的抗毒素（Ehrlich，1891b）。他先給鼠低劑量的蓖麻毒素，逐漸增加劑量，前五天沒有變化，第六天鼠對(duì)蓖麻毒素的耐受力大大提高（蓖麻毒素的致死劑量提高到最初的13倍），其后可以逐漸增加，但不能超過1000倍。主動(dòng)免疫延續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)于6個(gè)月。與白喉和破傷風(fēng)抗毒素一樣，產(chǎn)生了抗毒素的動(dòng)物之血液可以輸給其他的動(dòng)物而使之產(chǎn)生被動(dòng)免疫。被動(dòng)免疫時(shí)間遠(yuǎn)短于主動(dòng)免疫，但他沒有確定具體時(shí)間。同樣，他發(fā)現(xiàn)相思子毒素可以誘導(dǎo)免疫。兩種免疫都是特異的，沒有交叉，他提出不同毒素誘導(dǎo)的抗體是不同的。1892年，Ehrlich發(fā)表“免疫的遺傳和吮乳”一文，揭示新生鼠含母親來源的抗體，提示抗體可以傳過胎盤到達(dá)胎兒，而出生后的嬰兒還可以通過母乳再得到抗體，嬰兒的消化道不同于成人，沒有破壞抗體，而可以吸收抗體進(jìn)血液（Ehrlich，1892）。
因?yàn)樾什桓?、變異較大，Behring的抗白喉血清產(chǎn)量不穩(wěn)定，用其方法的工廠（Hoechst）難以獲得高效價(jià)的抗血清。Ehrlich的抗蓖麻毒素抗血清和抗相思子毒素抗血清有較高效價(jià)，而且Ehrlich檢測(cè)方法的定量化較好。在Behring邀請(qǐng)、Koch支持下， Ehrlich于1892年加入改進(jìn)抗白喉抗血清和抗破傷風(fēng)抗血清的生產(chǎn)。1894年Ehrlich等發(fā)表了“白喉抗血清的生產(chǎn)和應(yīng)用”（Ehrlich，Kossel，Wassermann，1894）。他們的改進(jìn)包括：用山羊（和牛）產(chǎn)生抗體；通過先用低劑量后增加劑量獲得高效價(jià)抗體；用標(biāo)準(zhǔn)制備的毒素在體外檢測(cè)抗血清中和毒素的比率，檢測(cè)抗血清的效價(jià)（“免疫單位”）。他們制備的抗血清很穩(wěn)定，臨床治療效果很好。他們還發(fā)現(xiàn)可以用山羊的乳汁獲得抗體，也有效果。血清含量是乳汁的20倍左右，但一天可獲30升乳汁，相當(dāng)于約1.5升的血。
1896年，普魯士教育部長(zhǎng)請(qǐng)Ehrlich建立“血清研究和檢測(cè)研究所”。Ehrlich費(fèi)很大精力標(biāo)準(zhǔn)化白喉抗血清的檢測(cè)方法。Ehrlich首先將毒素和抗毒素的作用視為化分子之間的相互作用（Ehrlich，1885，1897）：一個(gè)毒素分子與特定的不可改變量的抗體相結(jié)合（Ehrlich， 1897）。Ehrlich稱抗血清中起作用的分子為抗體（antik?rper，antibody）（Ehrlich，1897）。
對(duì)傳染病的預(yù)防和治療需求是人類開始免疫學(xué)的一條主線。另一條是對(duì)輸血的需求。
輸血：愿望和困境
有關(guān)血液，人類流傳很多不同看法、不乏浮想聯(lián)翩。所謂血型與性格的關(guān)系，長(zhǎng)期流傳而缺乏證據(jù)。所謂放血療法，歷史上常有人推廣而缺乏有效性的證據(jù)。
十九世紀(jì)，人類理解血液由細(xì)胞和血清兩部分組成。血清中含多種分子。紅細(xì)胞運(yùn)輸氧氣，白細(xì)胞有粒細(xì)胞（中性、嗜酸性、嗜堿性粒細(xì)胞）、吞噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種起防衛(wèi)機(jī)體的作用（Ehrlich，1878；Ehrlich，1891a；Ehrlich and Lazarus,1898），血小板通過凝結(jié)起封閉破裂血管的作用。缺血、或缺乏血液的特定成分可導(dǎo)致人類疾病。
人類從很早開始希望輸血、或補(bǔ)充血液中特定成分，但不同時(shí)期遇到不同的實(shí)際困難。在不懂免疫學(xué)之前，輸血有很大危險(xiǎn)。1901年，ABO血型的發(fā)現(xiàn)根本地改變了輸血的安全性，在第一次世界大戰(zhàn)開始成規(guī)模應(yīng)用，現(xiàn)在全世界幾萬所醫(yī)院每年進(jìn)行數(shù)以百萬至千萬次輸血，挽救了無數(shù)人的生命。
有爭(zhēng)議的傳說教皇無辜八世（Pope Innocent VIII, 原名Giovanni Battista Cybo，1432-1492）半昏迷后，醫(yī)生曾安排他與三位十歲的男孩換血，四人都去世。1656年，英國(guó)建筑家、科學(xué)家Christopher Wren（1632-1723）給狗注射過紅酒和啤酒（Maluf, 1954），1663年他和Robert Boyle（1627-1691）給狗進(jìn)行靜脈注射，雖然他們注射的是諸如酒和鴉片，也奠定了輸血的基本技術(shù)（Learoyd，2012a）。1665年2月，英國(guó)醫(yī)生Richard Lower（1631-1691）在兩只狗之間輸血（Lower，1666a，1666b；Maluf, 1954）。1667年6月15日，法國(guó)路易十四的御醫(yī)Jean-Baptise Denys（1643-1704）把12盎司的羊血輸給15歲的男孩，第二例是輸給勞工，兩人都活下來了。第三例是瑞典男爵Gustaf Bonde（1620-1667），在接受第二次羊血后去世。
當(dāng)時(shí)并不知道血液的功能，一方面氧氣尚未發(fā)現(xiàn)，另一方面還相信血與性格的關(guān)系。1667年11月23日， Lower和Edmund King（1630-1709）在皇家學(xué)會(huì)將羊血輸給Arthur Coga（Lower and King，1667），目的是為了改善其頭腦“太熱”，所以用溫順動(dòng)物（綿羊）的血（Maluf，1954）。法國(guó)Denys醫(yī)生用的第四例是經(jīng)常離家出走的瘋子Antoine Mauroy，其主人和妻子先后要求Denys輸小牛的血改變他，后來死亡（Maluf，1954）。這些做法以后當(dāng)然被質(zhì)疑。
輸血的安全性明顯有問題，法國(guó)、英國(guó)、教皇都禁止輸血近150年。在不懂血液功能、不懂消毒、不懂免疫的多重?zé)o知的情況下，輸血必定難以成功。
雖然十八世紀(jì)還有各種傳聞和不完備的記載，包括Eramus Darwin（1731-1802）曾設(shè)計(jì)過輸血的儀器，它不是輸血的熱門時(shí)期。但十八世紀(jì)的科學(xué)奠定了輸血的基本知識(shí)。英國(guó)的Joseph Priestley（1733-1804）和法國(guó)的Antoine Lavoisier（1743-1794）發(fā)現(xiàn)氧氣及其功能，以后才能理解血液給全身輸送氧氣的作用。從1242年阿拉伯學(xué)者Ibn al-Nafis（1213-1288）到1628年英國(guó)的William Harvey（1578-1657），人類終于理解了血液循環(huán)，明確心臟與血流的關(guān)系、血流的方向（Harvey，1628），澄清此前認(rèn)為血液無方向彌散全身等錯(cuò)誤觀點(diǎn)。
十九世紀(jì)，英國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)生James Blundell（1790-1878）進(jìn)行了第一次有確切記載的人與人之間輸血。鑒于產(chǎn)后出血常常導(dǎo)致死亡的危害，他提出輸血有益。1818年，他先用動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)，讓狗放血后，再注射來自動(dòng)物的血液。他證明不同種動(dòng)物之間輸血導(dǎo)致死亡（但在狗的血完全放完后，輸入羊血，狗可以恢復(fù)好幾天之后再死亡）（Blundell，1818）。他也發(fā)現(xiàn)血液不能在體外保存太長(zhǎng)時(shí)間（低于30秒）。他還證明給動(dòng)物輸來源于其自體的血是安全的，而且血液通過他發(fā)明的儀器重新回到動(dòng)物體內(nèi)是安全的。他實(shí)驗(yàn)了輸血過程需要防止混入氣泡導(dǎo)致的血管阻塞。1818年12月22日，在其他醫(yī)生要求下，他給一位瀕臨死亡的胃癌患者輸了來自幾位自愿者的血，狀態(tài)有好轉(zhuǎn)后兩天還是去世了（Blundell，1819）。1818年至1825年，他試過6例輸血，都不成功。1825年，他與Charles Waller (1802-1862)和Edward Doubleday（1799-1882）成功地給產(chǎn)后失血昏迷的婦女進(jìn)行輸血，并挽救她們的生命，其中第一例的血來自患者的丈夫，有些來自醫(yī)護(hù)人員（Doubleday, 1825; Waller, 1825; Dzik, 2018）。他還發(fā)明和比較了幾種輸血儀器（Blundell，1824，1829b）。輸血危險(xiǎn)性和不確定性仍然很明顯。
1869年，德國(guó)哥廷根大學(xué)生理研究所的醫(yī)學(xué)生Adolf Creite（1847-1921）發(fā)表他的觀察和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在法國(guó)Claude Bernard（1859）發(fā)現(xiàn)狗血清注射到兔導(dǎo)致兔出現(xiàn)血尿的基礎(chǔ)上，Creite給兔分別注射約8毫升的小牛、豬、狗、羊、貓、雞、鴨、或山羊血清，接受其中后5種血清注射后，兔的尿中出現(xiàn)血、生病、死亡。他猜想是血清所含蛋白質(zhì)導(dǎo)致兔的血尿。他進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，加熱處理血清，出現(xiàn)的蛋白質(zhì)凝聚物被過濾之后，再注射給兔，就不會(huì)有血尿和死亡。因此，他提出血清蛋白質(zhì)導(dǎo)致接受輸血的動(dòng)物紅細(xì)胞溶解。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)后，他還進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，將兔血與其他動(dòng)物的血清混合，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。他在體外也觀察到了紅細(xì)胞溶解、但對(duì)其重要性不甚明確（Creite，1869；Hughes-Jones and Gardner，2002）。
德國(guó)病理學(xué)家Emile Ponfick（1844-1913）于1874年向波羅的海醫(yī)生協(xié)會(huì)報(bào)告：一位34歲婦女死于輸羊血，他稱病理解剖發(fā)現(xiàn)其血含溶解的紅細(xì)胞。1875年，Ponfick通過羊?qū)份斞C明羊的紅細(xì)胞溶解、尿液含血紅蛋白（血紅蛋白尿），他進(jìn)一步證明狗的血紅蛋白尿來自羊，因?yàn)槿绻蛔⑸溲虻难?、而不是全血，狗就不?huì)有血紅蛋白尿（Ponfick，1875）。
1875年，德國(guó)生理學(xué)家Leonard Landois（1837-1902）出版了358頁的專著《輸血》，總結(jié)了1667年至1874年的478例輸血。其中129例輸動(dòng)物血給人，原作者號(hào)稱42例后患者有所改善，62例沒有改善，25例暫時(shí)改善但不可靠。347例人對(duì)人輸血，150例“改善”，180例不佳，12例不明，3例結(jié)果未知，2例在輸血過程中去世（Landois，1875；Maluf，1954）。他在體外顯微鏡研究八種動(dòng)物血清對(duì)其他動(dòng)物紅細(xì)胞的作用，觀察到一種的動(dòng)物血清導(dǎo)致另一種動(dòng)物紅細(xì)胞溶血和凝集作用（Landois，1875；Hughes-Jones and Gardner，2002）。
1894年，在Koch研究所工作的Richard Pfeiffer （1858-1945）發(fā)現(xiàn)“Pfeiffer現(xiàn)象”：將霍亂弧菌注射到對(duì)霍亂有免疫力的豚鼠或兔的腹腔，霍亂弧菌會(huì)變形然后溶解；如果將霍亂弧菌與少量對(duì)霍亂免疫的血清注射到對(duì)霍亂沒有免疫力動(dòng)物的腹腔，霍亂弧菌也會(huì)被溶解（bacteriolysis）（Pfeiffer，1894）。當(dāng)時(shí)Pfeiffer認(rèn)為這種現(xiàn)象只能在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生，而在法國(guó)巴斯德研究所的Metchnikoff證明在體外也一樣發(fā)生（Metchnikoff，1895）。1895年，在Metchnikoff實(shí)驗(yàn)室工作的比利時(shí)科學(xué)家Jules Bordet（1870-1961）發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在抗血清作用下出現(xiàn)凝集現(xiàn)象（Bordet，1895）。維也納大學(xué)的Max von Gruber（1853-1927）發(fā)現(xiàn)抗血清對(duì)霍亂和傷寒桿菌的凝集作用（Gruber and Durham，1896）。
1898年， Bordet在體外觀察到一種動(dòng)物血清一般都能導(dǎo)致另外一種動(dòng)物的紅細(xì)胞凝集，例如雞血清可凝集大鼠和兔的紅細(xì)胞。異種動(dòng)物血清也可以溶解紅細(xì)胞（如兔血清溶解豚鼠紅細(xì)胞），導(dǎo)致其內(nèi)含血紅蛋白外泄。55oC加熱處理血清可以滅活其溶血作用，但不影響其凝集作用。血清對(duì)紅細(xì)胞的溶血和凝集作用，與血清對(duì)細(xì)菌的作用很像，而且這兩種作用依賴的血清內(nèi)物質(zhì)對(duì)熱的敏感也類似，所以Bordet提出血清中影響紅細(xì)胞的物質(zhì)與血清中對(duì)抗細(xì)菌（如霍亂菌）的物質(zhì)類似。因此，Bordet的研究不僅明確血清對(duì)紅細(xì)胞的兩種作用，而且提出血清抗異種動(dòng)物紅細(xì)胞的機(jī)理類似于血清抗病原菌的機(jī)理（Bordet，1898，1899）。
Bordet的概念很快被接受。
Ehrlich指出：“很可能溶血的機(jī)理與溶菌的機(jī)理非常相似。因此溶血的研究就有相當(dāng)?shù)睦碚撘饬x”（Ehrlich and Morgenroth，1899）。而且Ehrlich與Julius Morgenroth（1871-1924）合作研究溶血，在1899年和1900年發(fā)表六篇“溶血”的研究論文（如：Ehrlich and Morgenroth，1899，1900a，1900b）。
從古代將輸血作為一個(gè)特殊問題，到19世紀(jì)末科學(xué)家終于確定輸血問題也是免疫問題。
血型：突破
因?yàn)镃reite（1869）發(fā)現(xiàn)體外可以觀察血清導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解和凝集、Landois（1875）進(jìn)一步使用體外紅細(xì)胞凝集和溶解的方法，實(shí)質(zhì)上建立了體外血型檢驗(yàn)的方法學(xué)。Bordet（1898，1899）提出血清對(duì)細(xì)菌和紅細(xì)胞的作用類似而將紅細(xì)胞的血型分析明確納入免疫學(xué)。
也就是說，十九世紀(jì)末，已經(jīng)出現(xiàn)大部分有關(guān)輸血的技術(shù)和科學(xué)基礎(chǔ)，但缺一關(guān)鍵：血型及其匹配。也是一種“萬事俱備，只欠東風(fēng)”。
1900和1901年，奧地利維也納大學(xué)病理解剖研究所的Karl Landsteiner（1868-1943）發(fā)現(xiàn)了人類的血型。檢測(cè)血型的方法非常簡(jiǎn)便而實(shí)用。今天我們知道有26種主要血型，至少270種不同紅細(xì)胞表型，Landsteiner發(fā)現(xiàn)了對(duì)輸血影響最大的ABO血型和Rh血型。
既然之前無人知道血型，Landsteiner不可能是為了發(fā)現(xiàn)血型而研究血液，而且他也不是為了輸血而研究血型。1900年，他先用動(dòng)物研究胰蛋白酶形成抗體，希望通過抗體來研究當(dāng)時(shí)化學(xué)不能區(qū)分的蛋白質(zhì)差異，他也研究了牛血清對(duì)豚鼠紅細(xì)胞的沉淀和凝集作用。他用碳酸或硫酸銨沉淀牛血清，將血清分成被碳酸所沉淀出來的球蛋白部分和其他部分。將溶液的氯化鈉濃度調(diào)到0.6%之后，可以溶解球蛋白。Landsteiner用豚鼠紅細(xì)胞來比較牛血清的球蛋白部分和非球蛋白部分的凝集作用，發(fā)現(xiàn)球蛋白作用強(qiáng)于其他部分。他也比較了球蛋白部分和非球蛋白部分對(duì)紅細(xì)胞的溶解作用，發(fā)現(xiàn)兩者沒有差別。在此過程中，他有其他觀察，他加在論文的注腳中：“健康人的血液可以凝集動(dòng)物的紅細(xì)胞，而且不同人的血液也可以凝集其他人的紅細(xì)胞。不清楚這樣現(xiàn)象是否源于個(gè)體差異、還是損失或細(xì)菌感染影響。重病人的血清這一現(xiàn)象更明顯。這一現(xiàn)象也許與1892年Maragliano發(fā)現(xiàn)的血清可以溶解多種疾病患者紅細(xì)胞的現(xiàn)象有關(guān)”（Landsteiner，1900）。
1900年的注腳成為1901年研究的起點(diǎn)（Landsteiner，1901）。Landsteiner首先澄清自己的研究與Maragliano（1892）不同，最大的差別在于Maragliano觀察到的溶血在同一個(gè)人的體內(nèi)發(fā)生，可能與疾病有關(guān)，而Landsteiner發(fā)現(xiàn)的紅細(xì)胞凝集和溶血只在不同個(gè)體的人之間發(fā)生。按Ehrlich and Morgenroth（1900a）的定義，Landsteiner指出自己研究的也是同種異體的凝集素和溶血素（isoagglutinins和isolysins）。他用三張表列出了做體外凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，含6位成年男性之間、6位產(chǎn)后女性之間、5位產(chǎn)后女性和6個(gè)胎盤的紅細(xì)胞之間的結(jié)果，另外還做了10位成人，其結(jié)果與表格顯示的一致。
表一可見，Sturli和Landsteiner本人（L）的紅細(xì)胞不會(huì)被其他五位的血清所凝集；Pletsching和Z兩位互相不凝集，也不凝集Sturli和L，但凝集Sturli和E；Sturli和E也互相不凝集，不凝集Sturli和L，但凝集Pletsching和Z。所以六位成年男性按紅細(xì)胞凝集情況可以分成三組。
表二可見，六位產(chǎn)后女性也分成三組：Linsm不與其他五位發(fā)生凝集；Seil、Mittelb和Tomsch三位互相不凝集，也不凝集Linsm，但凝集Lust和Graupn；Lust和Graupn也互相不凝集，不凝集Linsm，但凝集Seil、Mittelb和Tomsch。
表三可見，產(chǎn)后女性的血清與胎盤的紅細(xì)胞在凝集反應(yīng)中，就不如以上這么簡(jiǎn)單。Landsteiner提出以前Halban就發(fā)現(xiàn)嬰兒血清在凝集反應(yīng)也常常陰性。Josef Halban（1870-1937）是維也納大學(xué)的婦產(chǎn)科醫(yī)生，他讀過1900年Landsteiner文章的注腳后，用產(chǎn)婦和嬰兒的血做過凝集實(shí)驗(yàn)（Halban，1900）。
Landsteiner提出不考慮胎盤的紅細(xì)胞結(jié)果，可以看到成人血清和紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)呈三類：A、B、C。他將對(duì)其他不起反應(yīng)的稱為C，另外兩類為A和B。當(dāng)時(shí)所謂的C型，他后來改稱O型。他沒有交叉檢測(cè)六位男性和六位女性，所以并不確切知道男性的三類與女性的三類是否相同。他用的人數(shù)太少，所以沒有發(fā)現(xiàn)AB型。
文章結(jié)尾指出：“最后，不妨提到這些觀察可能協(xié)助解釋治療性輸血的各種后果”。
Landsteiner（1901）的研究相當(dāng)簡(jiǎn)單，但意義重大。基本技術(shù)非他發(fā)明，他是應(yīng)用已有技術(shù)，但他有想法。實(shí)驗(yàn)的操作也很簡(jiǎn)單，不需要實(shí)驗(yàn)高手。實(shí)驗(yàn)需要的時(shí)間也很短，一周做幾十人恐怕很容易，一天做幾十人也并非難事。說明：在生物學(xué)，有時(shí)候，想法也比技術(shù)、手段、努力要更重要。
當(dāng)時(shí)為什么沒有其他人用同樣方法研究血型？在他之前，已知不同個(gè)人之間輸血有問題，在一定程度上等于已經(jīng)用輸血來體內(nèi)檢測(cè)個(gè)體差異，但沒有科學(xué)家用體外實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)不同個(gè)體來源的血清和紅細(xì)胞之間的反應(yīng)。與Landsteiner研究最接近的是回到比利時(shí)的Bordet以及德國(guó)的Ehrlich和Morgenroth。Bordet在Landsteiner之前已經(jīng)做了很多體外血清和紅細(xì)胞的溶解和凝集反應(yīng)，而Ehrlich和Morgenroth接連發(fā)表了六篇體外血清和紅細(xì)胞的溶解和凝集反應(yīng)，每一篇都比Landsteiner（1901）的長(zhǎng)。Ehrlich和Morgenroth當(dāng)時(shí)集中探尋免疫的規(guī)律，特別是“側(cè)鏈學(xué)說”，可能忽視了從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作上都更容易解決的血型分析和匹配問題。在知道Landsteiner（1901）結(jié)果后，Ehrlich持反對(duì)態(tài)度：人為什么有個(gè)體間的免疫反應(yīng)？其他人不是病原菌，一個(gè)人用不著通過免疫系統(tǒng)對(duì)付其他人。這個(gè)問題當(dāng)然不是Landsteiner帶來的，因?yàn)樵缇椭廊藢?duì)人輸血經(jīng)常不成功，雖然以前可有多種如操作不當(dāng)、血液保存不妥等其他非免疫的原因，但到了1900年，應(yīng)該可以提出個(gè)體間的差異導(dǎo)致的免疫反應(yīng)是輸血困難的原因之一。但是，Ehrlich問題的簡(jiǎn)化版：為什么一個(gè)人在生理上要有機(jī)制破壞另一人的紅細(xì)胞？?jī)蓚€(gè)人的血從來不見面，自然界設(shè)計(jì)這種機(jī)理豈非多此一舉？這種問題確實(shí)不好回答，其答案的提示在Landsteiner的表3（雖然當(dāng)時(shí)他自己也不知道表3的意義）和本章的第6節(jié)（免疫耐受），問題需要反過來思考：為什么一個(gè)人的免疫系統(tǒng)不攻擊自己，只攻擊其他？
1900年Landsteiner的課題并非血清與紅細(xì)胞的關(guān)系，他最初試圖用血清來檢測(cè)蛋白質(zhì)的特征（包括來自不同動(dòng)物種屬的同一蛋白質(zhì)的差別）。他在1900年的注腳，燃起了自己的興趣，很快用簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)揭示了血型的規(guī)律，而且立即提供了可以用于臨床實(shí)踐的方法。但他那時(shí)研究并不如Bordet、Ehrlich、Morgenroth等。他的研究核心在想法，而實(shí)驗(yàn)方法是已有的，而且很簡(jiǎn)單。他只研究了二十幾個(gè)人，結(jié)論主要依賴12人。表1的六位成年男性屬于三類血型（兩位O型、兩位A型、兩位B型），表2的六成年位女性也屬于三類（一位O型、三位A型、兩位B型）。這種數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)上也不典型。當(dāng)然他說還做了10位，結(jié)果與此類似。但應(yīng)該做幾十例、上百例，才能確定大概多少類。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)便性，只能推測(cè)他實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有欠缺，而沒有花一、兩個(gè)月的時(shí)間做幾百例。
血型：從基礎(chǔ)回應(yīng)用
Landsteiner的樣本量太少，只發(fā)現(xiàn)了ABO 血型的A、B和O。1902年，他的學(xué)生Adriano Sturli（1873-1964）與維也納大學(xué)第二醫(yī)學(xué)診所的實(shí)習(xí)醫(yī)生Alfred von Decastello（1872-1960）合作研究了155人（121位病人、34位常人），他們發(fā)現(xiàn)其中4人很特別，他們的血清和紅細(xì)胞不互相凝集，其中任意一位的血清不凝集其他154人的紅細(xì)胞，但他們的紅細(xì)胞被所有這151人的血清所凝集（Decastello and Sturli，1872-1960）。Decastello和Sturli當(dāng)時(shí)把這4人稱為沒有特別的型（no particular type）。后人將AB血型的發(fā)現(xiàn)歸功于他們，因?yàn)檫@4位應(yīng)該是AB血型。他們還發(fā)現(xiàn)凝集素不會(huì)被疾病所改變，驗(yàn)證了6個(gè)月內(nèi)的新生兒的沒有血型反應(yīng)，這樣完成了ABO血型的發(fā)現(xiàn)。
美國(guó)醫(yī)生Reuben Ottenberg (1882-1959) 從五個(gè)家庭的樣本注意到同一家的血型相似性更高 (Epstein and Ottenberg，1908)。在德國(guó)海德堡實(shí)驗(yàn)癌癥研究所工作的醫(yī)生Emil von Dungern（1867-1961）和波蘭科學(xué)家Ludwig Hirszfeld（1884-1954）分析了72家的348人 (一般為兩代)，證明血型符合孟德爾遺傳規(guī)律(von Dungern and Hirszfeld，1910)。von Dungern 和Hirszfeld指出，對(duì)血型來說，雖然血清所含抗體很重要，細(xì)胞的抗原也很重要。他們提出A和B獨(dú)立遺傳，它們?yōu)閮蓚€(gè)獨(dú)立遺傳的基因、分別有兩個(gè)等位基因（A和a，B和b），A和B共顯性而它們都對(duì)O型顯性。德國(guó)猶太數(shù)學(xué)家Felix Bernstein（1878-1956）指出ABO血型由一個(gè)基因決定，A、B和O是同一個(gè)基因的三種等位基因，孩子從父母遺傳有六種可能性基因型（A/A，A/O，B/B，B/O，A/B和O/O）和四種表型（A，B，AB，O）（Bernstein，1924）。
ABO血型的確定，應(yīng)用意義很大，可能遠(yuǎn)大于其在免疫學(xué)的基礎(chǔ)意義?？梢酝ㄟ^事先體外試驗(yàn)匹配血型，大大地提高輸血的安全。按紅細(xì)胞表達(dá)抗原的情況，ABO血型有四類：表達(dá)A抗原的紅細(xì)胞，表達(dá)B抗原的紅細(xì)胞，表達(dá)A抗原和B抗原的紅細(xì)胞，既不表達(dá)A、也不表達(dá)B的O型紅細(xì)胞。O型的紅細(xì)胞不會(huì)被其他血型的血清所破壞，AB型的紅細(xì)胞會(huì)被其他三種血型的血清所含的抗A、抗B抗體所識(shí)別引起破壞，A型的紅細(xì)胞會(huì)被B型或O型血清所含抗A抗體十倍引起破壞、但不會(huì)被AB或A型血所破壞，B型紅細(xì)胞會(huì)被A型或O型血清所含抗B抗體而引起破壞、但不會(huì)被AB或B型血所破壞。
早期還需要克服醫(yī)生不用配血型，而直接用需要血液的患者作為檢測(cè)指標(biāo)的辦法：先給需要血液的患者慢速少量輸血，問問其反應(yīng)，如果可以就多輸，不行就停止。這種生物鑒定有一定的作用，但不可靠。
在多方推動(dòng)下，體外配血型成為標(biāo)準(zhǔn)步驟。在有了臨床簡(jiǎn)便可靠的檢測(cè)血型方法（Ottenberg，1911）、有了用檸檬酸抗凝血的辦法（Lewinsohn，1915）而可以在體外長(zhǎng)期保持血液之后，血庫才成為可能，大規(guī)模輸血得以推行。
免疫的“我”v“它”：免疫耐受
區(qū)分自我與非我，這一重要哲學(xué)問題的答案只能來自神經(jīng)生物學(xué)。
區(qū)分自我與非我也是免疫學(xué)的重要問題之一。免疫系統(tǒng)如果不能區(qū)分我與它，就會(huì)出現(xiàn)紊亂：免疫系統(tǒng)對(duì)自己進(jìn)行攻擊，是自身免疫疾病。免疫系統(tǒng)如果不能有效地發(fā)現(xiàn)有害的異己，是免疫缺陷，容易感染疾病。這些異己既包括外界入侵的病原微生物，也包括體內(nèi)的變化，如癌細(xì)胞。
對(duì)免疫系統(tǒng)來說，什么是自我? 什么是異己?如何解決這一問題?
1916年，芝加哥大學(xué)的Frank Lillie（1870-1941）發(fā)現(xiàn)雙生子在胚胎期有血液連通。如果雙生子一雄、一雌，雌性出生長(zhǎng)大后會(huì)出現(xiàn)不育現(xiàn)象，因?yàn)樘浩陂g血液連通導(dǎo)致雄性的雄激素由血液進(jìn)入雌性胎兒，后者受雄激素影響，以后不能生育，這種母牛稱為freemartin，造成農(nóng)民的損失，如果早期發(fā)現(xiàn)，可以不養(yǎng)大這種以后不能生育的牛。
Lillie對(duì)這一現(xiàn)象的解釋，引起農(nóng)民的孩子Ray Owen（1915-2014）讀研究生之后進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)：如果雙生的牛在胚胎時(shí)期血液連通，那么對(duì)免疫是否有影響。1945年，在美國(guó)威斯康辛大學(xué)的Owen發(fā)表了80對(duì)牛雙生子的血液抗原性的研究結(jié)果。他檢測(cè)了80對(duì)雙生牛的四十多種血液抗原，發(fā)現(xiàn)大部分雙生牛的血液抗原完全一樣（Owen，1945）。他推測(cè)不可能是因?yàn)樗鼈兌际腔驇缀跬耆嗤耐央p生，因?yàn)椋?）已知牛雙生子同卵雙生低于異卵雙生的幾率；2）雙生牛長(zhǎng)大后，其中一只不能完全將自己的抗原傳給后代，反過來說明它本身的抗原性并非都是遺傳因素造成；3）在罕見的來自不同父親、同一母親的兩只雙生牛的情況下，它們還是抗原完全相同，這不可能是遺傳所致；4）Owen發(fā)現(xiàn)部分雙生牛出生后含兩種不同的紅細(xì)胞。對(duì)這些結(jié)果的最簡(jiǎn)單解釋是因?yàn)榕咛テ陂g血液連通，雙生牛有細(xì)胞交換，而不僅Lillie提出的分子交換。交換的細(xì)胞可能有紅細(xì)胞的胚胎前體細(xì)胞，這樣在成年動(dòng)物血液發(fā)生系統(tǒng)中一生不斷產(chǎn)生新的紅細(xì)胞。
Owen提出其研究的一個(gè)應(yīng)用：可以在早期通過檢測(cè)血型抗原性知道雙生牛是否有血液連通，如果有連通，其抗原就會(huì)完全一樣，是freemartin而不用繼續(xù)養(yǎng)。如果不一樣則說明它們胎兒期間無連同血液，這種小母?？梢岳^續(xù)養(yǎng)。這種早期診斷freemartins的方法，可以為農(nóng)民節(jié)省資源。Owen回饋了類似自己父母的眾多農(nóng)民。
Owen再觀察到一對(duì)牛生的5胞胎，它們分別來自五個(gè)受精卵，但檢測(cè)其血型14種抗原，發(fā)現(xiàn)完全一樣，而且它們都擁有父母分別擁有的抗原（Owen et al., 1946）。Davis加州大學(xué)的研究者在羊也觀察到類似的結(jié)果（Stormont, Weir and Lane，1953）。
注意Owen研究的科學(xué)家不多。澳大利亞的科學(xué)家提出：Owen的實(shí)驗(yàn)的重要意義在于，胚胎期間種植的外源細(xì)胞可以被宿主永遠(yuǎn)耐受（Burnet and Fenner，1949）。
澳大利亞免疫學(xué)家Frank Macfarlane Burnet（1899-1985）長(zhǎng)期在位于墨爾本的Walter and Eliza Hall醫(yī)學(xué)研究所工作。在總結(jié)Owen研究的意義時(shí)（Burnet and Fenner，1949），他們還回顧了多個(gè)相關(guān)研究結(jié)果：大鼠肉瘤種植到成年雞引起免疫反應(yīng)，而種植到雞胚不引起免疫反應(yīng)（Murphy，1913）；白喉類毒素注射到雞胚不引起免疫反應(yīng)（Grasset，1929）；在兔（Baumgartner，1937）和雞（Wolfe and Dilks，1948）都呈現(xiàn)越年幼的動(dòng)物其免疫反應(yīng)越低；接種到12天雞胚的流感病毒，在第14天小雞檢測(cè)不到抗體，而在成年雞接種可以引起抗體反應(yīng)（Burnet，1941）。
我們還記得：Landsteiner文章表3胎盤的紅細(xì)胞血型就不容易定，他當(dāng)時(shí)決定擱置不考慮胎盤結(jié)果（Landsteiner，1901）。而這也是動(dòng)物年齡與免疫反應(yīng)關(guān)系。
南非出生的英國(guó)生物學(xué)家Peter Medawar （1915-1987）和他的同事在研究雙生牛的皮膚時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果進(jìn)行皮膚移植，不僅同卵雙生的牛之間沒有排斥反應(yīng)，異卵雙生的牛（即使其性別不同）之間皮膚移植也沒有排斥反應(yīng)，而兄弟姐妹之間皮膚移植有排斥反應(yīng)（Anderson et al., 1951；Billingham et al.，1952）。Medawar等認(rèn)為這與Owen的發(fā)現(xiàn)一致。他們認(rèn)為不太可能是移植物的抗原變化而適應(yīng)宿主，推測(cè)是宿主成年產(chǎn)生抗體的免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎期見過的抗原不再反應(yīng)。為此，他們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)“主動(dòng)獲得性免疫耐受”。他們較為詳細(xì)地?cái)⑹鰧?shí)驗(yàn)73（Billingham，Brent，Medawar，1953）。將來自一種小鼠（A）睪丸、腎臟、脾臟等器官組織的成年細(xì)胞注射到另一種（CBA）孕鼠的胚胎，5只幼鼠出生8周后，將A皮膚移植到CBA鼠，再等11天后，2只小鼠排斥移植皮膚，而三只小鼠對(duì)A的皮膚類似其對(duì)自體皮膚的移植，完全成功地接受了移植的皮膚。50天后再移植A的皮膚，也完全沒有免疫排斥。第77和101天，研究者從對(duì)A有強(qiáng)烈免疫性的CBA小鼠取得淋巴結(jié)，腹腔注射入胚胎期間接受過A皮膚移植的小鼠，移植的皮膚兩三天內(nèi)就脫落。接受過移植的CBA小鼠產(chǎn)生的后代對(duì)A皮膚仍然排斥。這一實(shí)驗(yàn)說明，移植皮膚的抗原性并未消失，也并非因胚胎期間注射的A細(xì)胞長(zhǎng)期存活，在成年競(jìng)爭(zhēng)抗體。免疫耐受不能遺傳給后代。他們還有其他實(shí)驗(yàn)表明，主動(dòng)獲得性免疫耐受有抗原特異性，胚胎期注射A細(xì)胞的CBA鼠，對(duì)A的免疫反應(yīng)降低，但對(duì)AU鼠來源的皮膚免疫反應(yīng)不變。他們給96只出生后的新生小鼠注射外源抗原，難以引起免疫耐受。他們還用雞做了實(shí)驗(yàn)，將11天的Rhode Island Red雞胚的血細(xì)胞注射同齡到White Leghorn雞胚，孵出14天后，Rhode Island Red的皮膚移植到White Leghorn的成功率也顯著提高（Billingham，Brent，Medawar，1953）。他們后來用了更多種屬的動(dòng)物（包括兔、大鼠和雙胞胎的雞）、樣本量和統(tǒng)計(jì)證明主動(dòng)獲得性免疫耐受（Billingham，Brent，Medawar，1956）。Medawar的基本結(jié)論，很快被其他研究者證明（Simonsen，1955，1956，1957；Ha?ek and Hraba，1955）。
1948年，Burnet提出自我標(biāo)記物（self markers），認(rèn)為個(gè)體對(duì)自己的細(xì)胞不發(fā)生免疫反應(yīng)的原因是每個(gè)細(xì)胞上都有少數(shù)幾個(gè)自我標(biāo)記物（Burnet and Fenner，1948），但不清楚自我標(biāo)記物與胚胎免疫耐受的關(guān)系（Burnet and Fenner，1949）。他對(duì)自我標(biāo)記的想法持續(xù)到1956年（Burnet，1956）。免疫耐受可以有兩種方法發(fā)生：要么身體的抗原都被抗體產(chǎn)生機(jī)制所識(shí)別為自我，要么所有外來抗原都被識(shí)別是異物（Burnet，1959）。Medawar的主動(dòng)獲得性免疫耐受實(shí)驗(yàn)說明免疫系統(tǒng)不需要識(shí)別自我，而只需要在胚胎時(shí)期清除識(shí)別自我的免疫機(jī)制，出生后新遇到的都是非我抗原。Burnet后來也承認(rèn)自我標(biāo)記物為半神秘的、缺乏吸引力（Burnet，1959）。Burnet在克隆選擇學(xué)說中提出胚胎期間身體不同組分直接相互作用，導(dǎo)致出生后不產(chǎn)生對(duì)身體可接觸部分的抗體（Burnet，1957，1959）。
免疫耐受還有更復(fù)雜和有趣的機(jī)理。宿主可以對(duì)移植物有免疫反應(yīng)，還有移植物對(duì)宿主的免疫反應(yīng)。而主要組織相容性復(fù)合物（Major histocampability complex，MHC）的作用更是妙趣橫生，但不在本章范圍。
抗體的產(chǎn)生和作用：側(cè)鏈學(xué)說
免疫學(xué)家多年試圖理解抗體形成的機(jī)理。
1900年，Ehrlich提出側(cè)鏈學(xué)說（side-chain theory）是第一個(gè)有影響的解釋抗體形成過程和作用機(jī)理的學(xué)說（Ehrlich，1900）。
Ehrlich的側(cè)鏈學(xué)說，與其早期研究不能全然分開（Ehrlich，1878，1885，1897；Ehrlich and Morgenroth，1900c；Prüll et al., 2009）。1878年，他在博士論文中提出染料與細(xì)胞結(jié)合需要“細(xì)胞特定的化學(xué)特征”。1885年，他首次提出側(cè)鏈（side-chains），認(rèn)為細(xì)胞的原生質(zhì)有起細(xì)胞主要作用的化學(xué)分子核團(tuán)，也有起營(yíng)養(yǎng)作用的化學(xué)分子側(cè)鏈（Ehrlich，1885）。1897年，Ehrlich提出了側(cè)鏈學(xué)說的雛形（Ehrlich，1897）：細(xì)胞的側(cè)鏈結(jié)合毒素，結(jié)合之后側(cè)鏈不能起正常功能從而使細(xì)胞補(bǔ)償性地產(chǎn)生更多的側(cè)鏈，進(jìn)入血液成為抗體，這一雛形相當(dāng)接近他1900年的學(xué)說，只是尚未明確提出側(cè)鏈在細(xì)胞膜。Ehrlich雖然起初認(rèn)為抗毒素結(jié)合毒素之后可以破壞毒素，后來認(rèn)為抗毒素是中和毒素的作用（Ehrlich，1898，1899）。
1900年的文章中，Ehrlich全面闡述其側(cè)鏈學(xué)說。他提出，細(xì)胞的原生質(zhì)有起細(xì)胞特異功能的中心部分，也有起營(yíng)養(yǎng)作用的側(cè)鏈。根據(jù)不同細(xì)胞的需求，側(cè)鏈有所不同。側(cè)鏈與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的原子團(tuán)與側(cè)鏈相應(yīng)的原子團(tuán)發(fā)生特異的結(jié)合。這種結(jié)合類似于Emil Fischer（1852-1919）提出的酶和底物的鎖和鑰匙的關(guān)系（Fischer，1894）。Ehrlich提出毒素有兩部分，結(jié)合部分（haptophore）與細(xì)胞的側(cè)鏈結(jié)合，毒性部分（toxophore）起毒性作用。如果細(xì)胞無側(cè)鏈，毒素不會(huì)對(duì)它起毒性作用，有天然免疫。如果細(xì)胞的側(cè)鏈與毒素結(jié)合足夠強(qiáng)，可以中和其毒性。如果給予毒素的劑量合適，側(cè)鏈結(jié)合毒素后可以不斷再生，產(chǎn)生新的側(cè)鏈太多后，被分泌入血液，成為抗毒素。免疫的過程就是細(xì)胞產(chǎn)生和分泌側(cè)鏈的過程，血清的抗毒素或抗體來源于細(xì)胞的側(cè)鏈。
他還提出，不同的抗體可能來源于身體不同的細(xì)胞。單個(gè)抗體的免疫力可能不足，需要多個(gè)抗體。用整體細(xì)菌比用細(xì)菌細(xì)胞單個(gè)代謝產(chǎn)物更有效誘導(dǎo)多種抗體產(chǎn)生，這樣免疫力更強(qiáng)。
側(cè)鏈學(xué)說面臨很多批評(píng)。首先，如何解釋免疫系統(tǒng)事先存在對(duì)大量抗原有特異性的抗體。其次，如果抗體存在于毒素作用的靶細(xì)胞，那么如何解釋免疫存在于血液而不存在于靶器官的情形。例如破傷風(fēng)毒素作用于神經(jīng)系統(tǒng)，但其抗體不存在于神經(jīng)系統(tǒng)，而在血液。事后，可以看到毒素作用的靶細(xì)胞和抗體產(chǎn)生的細(xì)胞并非同一細(xì)胞，毒素作用的靶分子也無需是抗體分子，Ehrlich當(dāng)時(shí)將兩種細(xì)胞、兩種與毒素結(jié)合的不同分子當(dāng)成同一細(xì)胞、同一分子，解釋確實(shí)簡(jiǎn)單，但并非體內(nèi)的實(shí)際情況。其三，側(cè)鏈起營(yíng)養(yǎng)性作用的看法也備受質(zhì)疑（Silverstein，2002）。
但是，Ehrlich的側(cè)鏈學(xué)說考慮了抗原-抗體特異結(jié)合、抗體為體內(nèi)已有分子、抗原選擇性促進(jìn)抗體產(chǎn)生等因素，是第一個(gè)有影響的抗體形成理論。在其前后，曾有幾位研究者推測(cè)抗體來源于抗原，都被棄之不用且不影響以后的理論（Hertzfeld and Klinger，1918；Silverstein，2009）。
克隆選擇學(xué)說
抗體形成的理論需要解釋當(dāng)時(shí)已知現(xiàn)象：對(duì)抗原的特異性，對(duì)多種抗原的反應(yīng)，第二次引入抗原導(dǎo)致的反應(yīng)大于第一次（Glenny and Südmersen，1921），對(duì)自身的抗原有免疫耐受。
抗體形成有直接模板學(xué)說、間接模板學(xué)說和選擇學(xué)說。
Ehrlich的側(cè)鏈學(xué)說是選擇學(xué)說的第一個(gè)版本。
直接模板學(xué)說有幾個(gè)版本，都認(rèn)為抗原直接作為抗體的模板（Bail and Tsuda，1909；Breinl and Haurowitz，1930；Mudd，1932；Pauling，1940；Pauling and Delbrück，1940；Pauling, Campbell and Pressman，1943）?？梢允菄@抗原進(jìn)行抗體合成或組裝（Mudd，1932），或在抗原誘導(dǎo)抗體改變其構(gòu)型從而特異結(jié)合和識(shí)別（Pauling，1940；Pauling and Delbrück，1940；Pauling, Campbell and Pressman，1943）。
抗體形成的間接模板學(xué)說首先由Burnet等提出。1941年，他們提出適應(yīng)酶學(xué)說，認(rèn)為抗原進(jìn)入產(chǎn)生抗體的細(xì)胞后，通過誘導(dǎo)酶的改變，讓細(xì)胞生產(chǎn)對(duì)抗原特異的抗體（Burnet et al.，1941）。1949年，他們提出抗原進(jìn)入細(xì)胞核或細(xì)胞漿，改變細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致能夠識(shí)別抗原的特異抗體產(chǎn)生（Burnet and Fenner，1949）。這一假說，到1955年Burnet寫作時(shí)出現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)互為模板、自我標(biāo)記物改變模板的復(fù)雜版本（Burnet，1956）。
1955年，丹麥免疫學(xué)家Niels Jerne（1911-1994）提出抗體形成的自然選擇學(xué)說：抗原進(jìn)入身體后，在大量的已有抗體中與其中有互補(bǔ)構(gòu)型的抗體相結(jié)合，抗原-抗體復(fù)合物被吞食細(xì)胞所攝取，之后抗原-抗體分開，抗原被破壞?？乖?抗體進(jìn)入細(xì)胞后，引起細(xì)胞合成更多的同一抗體，改變血清中抗體的組成比，同一抗原再次進(jìn)入體內(nèi)時(shí)將遇到更多的這一抗體，而且有更多產(chǎn)生這一抗體的細(xì)胞，所以反應(yīng)更大。
1957年，平壤出生的當(dāng)時(shí)在美國(guó)芝加哥大學(xué)的David Talmage（1919-2014）從過敏的實(shí)質(zhì)是免疫的觀點(diǎn)出發(fā)，認(rèn)為要理解過敏就要理解抗體，從而討論抗體的產(chǎn)生。他指出Jerne的理論在本質(zhì)上與Ehrlich的側(cè)鏈學(xué)說有相似性：都是抗原選擇抗體。但他們的差別在于Jerne認(rèn)為抗原與游離的抗體結(jié)合，而Ehrlich提出抗原與細(xì)胞膜表面的抗體結(jié)合。Talmage認(rèn)為細(xì)胞表面的抗體更合理，抗原選擇表面有特定抗體的細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞增殖，產(chǎn)生更多的同一抗體（Talmage，1957）。
在以上基礎(chǔ)上，多年思考抗體形成機(jī)理的Burnet提出了抗體形成的克隆選擇學(xué)說（Burnet，1957）。Burnet長(zhǎng)期研究病毒，但因參與調(diào)查疫苗事故而研究免疫學(xué)，并觀察到胚胎與免疫耐受的關(guān)系（Burnet, 1941）和第二次免疫反應(yīng)大于第一次免疫反應(yīng)的現(xiàn)象（Burnet et al., 1941）。很難用直接模板學(xué)說解釋為什么第二次免疫反應(yīng)大于第一次（Glenny and Südmersen，1921；Burnet et al., 1941）。Burnet持續(xù)認(rèn)真思考免疫學(xué)理論（Burnet，1948，1949），對(duì)Owen、Jerne和Talmage的文章都很敏感，再版書的時(shí)候不斷根據(jù)新的進(jìn)展更新自己的理論。
1957年8月的一個(gè)周末，Burnet寫下了抗體形成的克隆選擇學(xué)說（Burnet，1957）。他首先回顧了Talmage（1957）對(duì)于抗體形成理論的三種分類：直接模板、間接模板和Jerne（1955）的選擇學(xué)說。他指出自己曾提出的區(qū)別自我和非我的“自我標(biāo)記”想法現(xiàn)在看來是錯(cuò)誤的，當(dāng)時(shí)實(shí)在難以想象免疫系統(tǒng)怎么可能識(shí)別所有外來抗原。Burnet認(rèn)為體內(nèi)已有自然抗體的多樣性可以很好解決區(qū)別自我和非我的問題，然后復(fù)述了Jerne的選擇學(xué)說。Burnet指出Talmage（1957）認(rèn)為Jerne的學(xué)說是Ehrlich側(cè)鏈學(xué)說的擴(kuò)展，并提出選擇是在細(xì)胞水平進(jìn)行。Burnet提到自己在Talmage文章之前有類似想法，但不僅是細(xì)胞，而且是同樣細(xì)胞的克隆。抗體產(chǎn)生細(xì)胞的表面含抗原反應(yīng)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與同一細(xì)胞合成的抗體一致（它們識(shí)別同樣的抗原）。這些細(xì)胞可以釋放抗體，也可以增殖產(chǎn)生更多同樣的細(xì)胞?？乖M(jìn)入身體后，附著到含結(jié)合其位點(diǎn)的細(xì)胞上，刺激細(xì)胞增殖（Gowans，1957；Simonsen，1957）。能夠識(shí)別抗原的細(xì)胞得到刺激而增殖，其后代可以分泌相應(yīng)的可溶性抗體，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。第二次免疫時(shí)，因?yàn)橐延性鲋车募?xì)胞，所以反應(yīng)大于第一次。
Burnet在美國(guó)Vanderbilt大學(xué)進(jìn)行系列演講后，在其后的書中更詳細(xì)地進(jìn)行了闡述（Burnet，1959）。他先復(fù)習(xí)了細(xì)菌和病毒的克隆、突變和選擇。再列舉了免疫的基本事實(shí)：抗體是血清中的球蛋白，第一次和第二次免疫反應(yīng)的差別，對(duì)自身的免疫耐受，淋巴組織的細(xì)胞參與免疫反應(yīng)等。他已明確指出產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是淋巴細(xì)胞及其相關(guān)的漿細(xì)胞（Fagraeus，1947；Coons, Leduc and Connolly，1955）。他也分析了產(chǎn)生自身耐受的可能機(jī)理。在抗體形成理論方面，他回顧了Ehrlich的側(cè)鏈理論、Haurowitz-Pauling的直接模板理論、Burnet-Fenner的間接模板理論、Jerne的自然選擇理論和克隆選擇理論。
Burnet也明確提出：胚胎發(fā)育早期，有多種細(xì)胞，分別可以產(chǎn)生不同的抗體。與自身已有抗原接觸后，有反應(yīng)的細(xì)胞被清除，因而有自身免疫耐受。出生后，釋放抗體，或產(chǎn)生抗體。
Talmage和Burnet都意識(shí)到，他們的假說帶來兩個(gè)要求：每種細(xì)胞只產(chǎn)生一種抗體（Talmage，1957；Burnet，1957）；Jerne、Talmage和Burnet的假說都需要個(gè)體能夠產(chǎn)生數(shù)量很多的不同抗體。第一個(gè)要求很快被證明。第二個(gè)問題需要較長(zhǎng)時(shí)間。
Gustav Nossal（1931-）醫(yī)學(xué)院畢業(yè)后到Burnet實(shí)驗(yàn)室讀研究生。他和來訪的美國(guó)生物學(xué)家Joshua Lederberg（1925-2008）合作，用針對(duì)細(xì)菌鞭毛的抗體證明單個(gè)脾臟來源的細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體（Nossal and Lederberg，1958；Nossal，1958），這一實(shí)驗(yàn)最后可以做到3628個(gè)細(xì)胞，只有兩個(gè)細(xì)胞可能產(chǎn)生了兩種抗體（或一種可以識(shí)別兩個(gè)抗原的二價(jià)抗體），而其他3626個(gè)細(xì)胞都只能產(chǎn)生一種抗體（Nossal and M?kel?，1960）。
1965年，確定了產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）的來源（Cooper, Peterson and Good，1965）。造血干細(xì)胞產(chǎn)生前B細(xì)胞，成為B細(xì)胞，受抗原刺激后成為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌抗體。
抗體蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)
抗體是蛋白質(zhì)為多年研究的結(jié)論（e.g.，F(xiàn)elton，1928；Heidelberger and Kendall，1929，1935，1936；McFarlane，1935；Chow and Wu，1936；Tiselius，1937；Tiselius and Kabat，1938；Pauling，1940；Scheer, Lagsdin and Wyckoff，1941；Scheer et al., 1941）。按蛋白質(zhì)電泳特征稱為γ球蛋白（中文曾稱為丙種球蛋白）（Tiselius，1937；Tiselius and Kabat，1938），按功能稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。
主要在英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)研究所的Rodney Porter（1917-1985）、主要工作在美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)和印第安納大學(xué)的Frank Putnam（1917-2006）和洛克菲勒大學(xué)的Gerald Edelman（1929-2014）等實(shí)驗(yàn)室揭示了Ig的基本結(jié)構(gòu)（Porter，1959；Edelman and Poulik,1961; Edelman and Gally, 1962，1967；Putnam et al., 1963；Edelman et al., 1969）。Ig可以被木瓜蛋白酶(和胰蛋白酶)切為Fab段和Fc段（Porter，1950；Fried and Putnam，1960；Nisonoff et al.，1959），又可以通過二硫鍵還原分開（Edelman，1959； Nisonoff et al., 1960；Franěk，1961），由重鏈和輕鏈組成（Edelman and Poulik，1961）。1963年了解的抗體基本結(jié)構(gòu)如圖（Fleischman, Porter and Press，1963）：
到1967年確定一條輕鏈全部序列（Wikler et al., 1967）、1969年確定同一個(gè)Ig的輕鏈和重鏈全部序列后獲得更準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)（Edelman et al., 1969）。一般哺乳動(dòng)物Ig的概貌：兩條輕鏈和兩條重鏈，輕鏈兩百多氨基酸殘基、重鏈五百多氨基酸殘基。兩條重鏈之間以二硫鍵共價(jià)連接，輕鏈也以二硫鍵分別與一條重鏈結(jié)合。重鏈和輕鏈的氨基端為可變區(qū)域（V區(qū)），九十多個(gè)氨基酸組成，V區(qū)差異最大的部分被推斷為抗體結(jié)合區(qū)域（Wu and Kabat，1970）。重鏈的羧基部分為恒定區(qū)域（C區(qū)）可以與補(bǔ)體結(jié)合，引起補(bǔ)體反應(yīng)。
1968年，美國(guó)國(guó)家健康研究院（NIH）的科學(xué)家解析了Ig的晶體結(jié)構(gòu)（Terry, Matthew and Davis, 1968）。此后進(jìn)一步工作得到更精確的結(jié)果（Silverton, Navia and Davis，1978）。
按照其Fc段的差別，Ig通常分為五類：IgA，IgD，IgE，IgG，IgM。在抗原第一次刺激B細(xì)胞時(shí)，B細(xì)胞表面主要是IgM、IgD，之后出現(xiàn)類型轉(zhuǎn)變（class switching）（Wang et al., 1970），產(chǎn)生和分泌IgG（和IgE、IgA）。
IgD、IgE和IgG的結(jié)構(gòu)為典型的兩條輕鏈和兩條重鏈。而IgA是二聚體，由兩個(gè)這樣的亞單位組成。IgM是五聚體，由五個(gè)同樣的亞基組成。導(dǎo)致紅細(xì)胞（和細(xì)菌）凝集反應(yīng)的原因是一般Ig至少有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可以同時(shí)結(jié)合抗原性相同的兩個(gè)細(xì)胞。而多聚體的抗體更可以結(jié)合更多具有相同抗原的細(xì)胞。
對(duì)Ig的蛋白質(zhì)研究得益于發(fā)現(xiàn)“Bences-Jones蛋白質(zhì)”。1884年，英國(guó)醫(yī)生Henry Bence Jones（1813-1873）從當(dāng)時(shí)所謂“軟骨病”人的尿液分析發(fā)現(xiàn)后來稱為Bence Jones蛋白質(zhì)的物質(zhì)（Bence Jones，1848）。這種病人實(shí)際是多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma）。從孤兒成長(zhǎng)為科學(xué)家的Putnam多年研究骨髓瘤分泌的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它們是Ig（Putnam and Udin，1953；Putnam，1962）。Edelman確定它們是Ig的輕鏈（Edelman and Poulik，1962；Edelman and Gally，1962），每一骨髓瘤分泌單一的（“單克隆”）Ig輕鏈（Potter et al.，1964）?？梢杂没瘜W(xué)誘變劑導(dǎo)致正常鼠發(fā)生骨髓瘤（Potter and Boyce，1962），得到不同的骨髓瘤用于研究。發(fā)現(xiàn)骨髓瘤的抗體特征為發(fā)明單克隆抗體的制備技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，當(dāng)時(shí)很快因?yàn)榭梢詭椭@得大量同一蛋白質(zhì)而有助于研究Ig的氨基酸序列。輕鏈的氨基酸序列得到確定（Hilschman and Craig，1965；Titani et al., 1965；Bennett et al.，1965；Putnam, Titani and Whitley，1966；Titani, Shinoda and Putnam，1969）。同一Ig的全部氨基酸序列也得到確定（Edelman et al., 1969），從而明確同一Ig重鏈和輕鏈的V區(qū)相似，更清晰重鏈和輕鏈有多少個(gè)二硫鍵相連。
抗體多樣性產(chǎn)生的多種可能模型
一個(gè)人的一生中可以產(chǎn)生很多種抗體，有一種估計(jì)是1011種抗體。
動(dòng)物可以產(chǎn)生特異的抗體不僅對(duì)毒素、對(duì)病原菌，而且對(duì)化學(xué)分子，包括自然界不存在的化學(xué)分子。Landsteiner發(fā)現(xiàn)有很多化學(xué)差別能夠引起不同的抗體，讓人們大開眼界認(rèn)識(shí)到多樣性不是僅僅針對(duì)病原菌，而是識(shí)別化學(xué)特異性（Landsteiner，1936）。
每個(gè)動(dòng)物的個(gè)體如何產(chǎn)生數(shù)量眾多的不同抗體?
爭(zhēng)論的核心問題在于：“多基因”對(duì)“少基因”， “種系發(fā)生細(xì)胞”對(duì)“體細(xì)胞”。一種觀點(diǎn)認(rèn)為抗體的基因全是進(jìn)化過程中積累產(chǎn)生了，在種系發(fā)生細(xì)胞有很多編碼抗體蛋白質(zhì)的基因，甚至一一對(duì)應(yīng)各種不同的抗體。另一觀點(diǎn)認(rèn)為種系發(fā)生細(xì)胞只有很少與抗體蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因，在體細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生更多基因（或其重組、突變）而編碼所有抗體。
曾有多個(gè)假說，例如：
1）多年認(rèn)為抗體產(chǎn)生有如酶的適應(yīng)性的Burnet曾認(rèn)為無需提出基因是抗體特異性的原因（Burnet and Fenner，1948）；
2）分子生物學(xué)家Lederberg于1959年提出基因與抗體的關(guān)系：抗體蛋白質(zhì)的特異性由其特定氨基酸序列所決定；產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞含相應(yīng)的特定核苷酸序列；抗體形成細(xì)胞的基因多樣性源自其一生增殖過程中很高的自發(fā)突變率；高突變率包括細(xì)胞增殖某些時(shí)期Ig的DNA組裝隨機(jī)性。每個(gè)細(xì)胞在開始成熟時(shí)，按其基因型自發(fā)產(chǎn)生少量抗體；未成熟的抗體形成細(xì)胞在遇到同源抗原時(shí)被抑制（可以是消除細(xì)胞）；成熟的抗體形成細(xì)胞在同源刺激下成為漿細(xì)胞；抗原刺激的成熟細(xì)胞增殖，但基因型穩(wěn)定，因而細(xì)胞克隆增大，產(chǎn)生同源抗體；抗原消失后，這些克隆仍然存在，一旦遇到同樣抗原可以很快出現(xiàn)抗體反應(yīng)（Lederberg，1959）；
3）物理學(xué)家Leo Szilard（1898-1964）于1960年提出抗體產(chǎn)生的理論。從細(xì)菌基因的重量和哺乳動(dòng)物一個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA的重量，他推算一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可有一百萬種基因，他認(rèn)為每一種抗原可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過結(jié)合特異的酶，而酶影響特異的抑制子，抑制子抑制特異抗體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，抗原的作用在于對(duì)相應(yīng)抗體的產(chǎn)生去抑制（Szilard，1960）。這一理論需要在種系發(fā)生細(xì)胞就存在很多基因，不需要體細(xì)胞基因改變。這一理論的基礎(chǔ)之一（細(xì)胞所含基因數(shù)量）錯(cuò)了，1990年代全基因組測(cè)序顯示人的細(xì)胞能夠編碼蛋白質(zhì)的基因約兩萬而已；
4）1962年，當(dāng)時(shí)在美國(guó)Wisconsin大學(xué)的英國(guó)科學(xué)家Oliver Smithies（1925-2017）等提出結(jié)合珠蛋白（haptoglobin）的基因可以有基因重組（特別是基因復(fù)制duplication）和點(diǎn)突變（Smithies, Connell and Dixon，1962）。1963年，Smithies提出同一條染色體基因重組（特別是基因交叉及其導(dǎo)致的倒位）是Ig多樣性的機(jī)理之一，另一機(jī)理為Ig基因的堿基突變（增加或減少堿基導(dǎo)致移碼突變）（Smithies，1963；1967）；
5）1965年，加州理工學(xué)院的William Dreyer（1928-2004）和Claude Bennett提出：在種系發(fā)生細(xì)胞的同一條染色體上，一部分由多個(gè)編碼V區(qū)的序列重復(fù)組成（例如成為環(huán)狀DNA）。而編碼C區(qū)的序列可以如細(xì)菌病毒形成過程一樣在染色體之外。在體細(xì)胞分化過程中，C區(qū)域的DNA只與V區(qū)域序列之一（多個(gè)環(huán)之一）匹配而產(chǎn)生獨(dú)特的輕鏈（Dreyer and Bennett，1965）；
6）意大利納布納斯國(guó)際遺傳學(xué)和生物物理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家提出：編碼Ig的基因其遺傳密碼有特殊性，同一個(gè)密碼可以被翻譯成為不同的氨基酸（Potter，Appella，Geisser，1965）。也許從幾百個(gè)特殊區(qū)域選其中一到兩個(gè)與C區(qū)組成一條Ig（Cioli and Baglion，1966）；
7）Leroy Hood（1938-）成為加州理工學(xué)院Dreyer的研究生，他們提出：N端V區(qū)的肽段與C端分別由兩個(gè)基因指導(dǎo)編碼產(chǎn)生，之后兩個(gè)肽段由酶促反應(yīng)所連接稱為單個(gè)肽段，或編碼N端和C端的兩個(gè)基因融合、或其RNA融合（Hood, Gray and Dreyer，1966）；
8）劍橋的英國(guó)醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)（MRC）的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（LMB）的分子生物學(xué)家Sydney Brenner（1927-2019）與免疫學(xué)家César Milstein（1927-2002）提出：編碼共同區(qū)域的核酸序列是酶的識(shí)別位點(diǎn)，這種酶切割DNA，切割后DNA在修復(fù)過程中在V區(qū)引入變異（Brenner and Milstein，1966）；
9）Edelman提出：在進(jìn)化過程中，編碼Ig的基因發(fā)生串接重復(fù)（tandem duplication），可能重復(fù)到50個(gè)左右。它們出現(xiàn)點(diǎn)突變，從而不同。在哺乳動(dòng)物個(gè)體的淋巴細(xì)胞成熟過程中，出現(xiàn)體細(xì)胞的DNA交叉（somatic cross-over），產(chǎn)生基因突變（Edelman and Gally，1967）；
10）劍橋大學(xué)植物系的遺傳學(xué)家提出在同一個(gè)染色體上，有多個(gè)編碼Ig的基因重復(fù)排列，淋巴細(xì)胞成熟過程中，發(fā)生同一染色體內(nèi)的交叉（intrachromosomal cross-over），兩個(gè)基因連在一起編碼一個(gè)Ig（Whitehouse，1967），這一假說在Dreyer and Bennett（1965）基礎(chǔ)上進(jìn)了一步，編碼C區(qū)的基因不再是在染色體外，而是與編碼V區(qū)的基因同在一條染色體上；
11）伯克利加州大學(xué)科學(xué)家提出編碼V區(qū)域的基因與編碼C區(qū)域的基因需要在DNA或RNA水平連接（Koshland, Davis and Fujita，1969）;
12) 到1970年，Hood和Talmage還認(rèn)為種系發(fā)生假說更有吸引力（Hood and Talmage，1970）；
13）Edelman提出：在淋巴細(xì)胞成熟過程中，編碼V區(qū)的多個(gè)基因中的一個(gè)因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)位（translocation）而與編碼C區(qū)的連接在一起，編碼Ig（Gally and Edelman，1970）；
14）Jerne提出免疫器官是突變發(fā)生器官（mutant-breeding organs），其中淋巴細(xì)胞編碼Ig的基因出現(xiàn)體細(xì)胞基因突變，生成多種抗體（Jerne，1971）；
15）Salk研究所的Melvin Cohn（1922-2018）提出：所有體細(xì)胞都有低頻的基因突變，種系發(fā)生細(xì)胞有25到50個(gè)V基因，這些基因在體細(xì)胞中出現(xiàn)低頻突變，在高變異區(qū)域的突變比其他序列高10到100倍（Cohn，1971）；
16）英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家提出有三套V基因，都存在于種系發(fā)生細(xì)胞（Williamson，1972）。
綜上所述，僅僅依據(jù)于當(dāng)時(shí)已知Ig的輕鏈和重鏈有V區(qū)和C區(qū)、V區(qū)有多種氨基酸序列，可以提出多種假說。每一種假說都有其理由，而且提出者常指出其他假說為什么不對(duì)，但不能停留在猜測(cè)。
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)確定抗體產(chǎn)生的機(jī)理
只有實(shí)驗(yàn)?zāi)艽_定抗體產(chǎn)生的確切機(jī)理。
種系發(fā)生細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為對(duì)應(yīng)于每一個(gè)抗體（包括其V區(qū)）都有一個(gè)特定的基因，就有較多基因；而體細(xì)胞變異學(xué)說認(rèn)為變異導(dǎo)致更多基因，早期不需要很多基因。所以，區(qū)分這兩類假說最簡(jiǎn)單的方法是檢測(cè)編碼V區(qū)基因的數(shù)量。
第一個(gè)用實(shí)驗(yàn)推測(cè)抗體基因數(shù)量的是美國(guó)西雅圖華盛頓大學(xué)的Ursula Storb。她取脾臟的DNA，放射性標(biāo)記脾臟和骨髓瘤的RNA，看它們之間的雜交量，而加沒有標(biāo)記的肝臟RNA作為沒有抗體RNA的來源。她假定肝臟RNA競(jìng)爭(zhēng)掉了非Ig的基因結(jié)合，剩下的主要是Ig的基因與脾臟和骨髓瘤的RNA結(jié)合。以此，她得到結(jié)果推測(cè)每半個(gè)基因組有6千到1萬4千個(gè)序列可以編碼Ig的V區(qū)。因這一數(shù)量足夠大，她認(rèn)為支持抗體變異的種系發(fā)生細(xì)胞學(xué)說（Storb，1972）。
這種方法有很多影響因素，推測(cè)不夠準(zhǔn)確。更可靠的方法需要提取Ig重鏈或輕鏈的mRNA，在體外翻譯系統(tǒng)證明其編碼Ig，高度特異標(biāo)記這種mRNA或其cDNA，檢測(cè)它與基因組DNA的雜交速率，從而推測(cè)DNA的拷貝數(shù)（Delovitch and Baglioni，1973）。在不能DNA測(cè)序的情況下，當(dāng)時(shí)能用于分析DNA重復(fù)序列拷貝數(shù)的是C0t分析（Waring and Britten，1966；Britten and Kohne，1968）。以此方法，麻省理工學(xué)院（MIT）的科學(xué)家提取骨髓瘤MPC11中編碼Ig輕鏈的mRNA，它與肝臟或骨髓瘤的DNA雜交，推測(cè)重復(fù)數(shù)為40到500，不足以支持種系發(fā)生細(xì)胞學(xué)說 (Delovitch and Baglioni，1972，1973)。
紐約市立大學(xué)的研究者分析多種哺乳類動(dòng)物的重鏈V區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)它們的變化有進(jìn)化規(guī)律，而且有限，認(rèn)為支持少基因的體細(xì)胞變異學(xué)說（Capra, Wasserman and Kehoe，1973）。
1974年，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了C0t分析。Storb的結(jié)果推測(cè)有2500到5000個(gè)κ輕鏈的V區(qū)（Vκ）基因，繼續(xù)支持種系發(fā)生細(xì)胞學(xué)說（Storb，1974）。洛杉磯加州大學(xué)（UCLA）的Williamson推測(cè)重鏈的V區(qū)（VH）基因有5000個(gè)，也支持種系發(fā)生細(xì)胞學(xué)說（Premkumar，Shoyab and Williamson，1974）。但是，在瑞士Basel免疫研究所工作的日本科學(xué)家利根川進(jìn)（1939-）等的結(jié)果都支持少基因?qū)W說。利根川進(jìn)通過MPOC70E骨髓瘤獲得的結(jié)果推算小鼠每半基因組最低可能只有一個(gè)Vκ基因、最高200個(gè)（Tonegawa et al., 1974a）。劍橋大學(xué)的科學(xué)家用MPOC21骨髓瘤的結(jié)果推算有1到250個(gè)Vκ基因（Rabbits et al.，1974）。利根川進(jìn)分析MPC11骨髓瘤的Ig重鏈基因推算小鼠每半基因組可能只有一個(gè)VH基因（Bernadini and Tonegawa, 1974）。瑞士科學(xué)家分析MPOC41骨髓瘤的結(jié)果支持只有兩個(gè)拷貝的CH基因（Faust, Diggelman and Mach，1974）。用高度純化的MPOC41來源的Cκ的mRNA，當(dāng)時(shí)在NIH的Philip Leder （1934-）實(shí)驗(yàn)室工作的本庶佑（Tasuku Honjo，1942-）等推測(cè)它只有2到3個(gè)拷貝，不支持種系發(fā)生細(xì)胞學(xué)說（Honjo et al.，1974）。舊金山加州大學(xué)的研究者也推測(cè)Cκ只有3到4個(gè)拷貝（Stavnezer et al.，1974）。利根川進(jìn)在更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下得到的數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持Vκ基因數(shù)量可能為1、不超過200（Tonegawa et al., 1974b）。
Milstein實(shí)驗(yàn)室從MPOC21骨髓瘤純化了編碼其κ輕鏈的mRNA，并進(jìn)行了DNA短片段的序列測(cè)定（Brownlee et al.，1973）。進(jìn)一步分析多個(gè)小片段的序列后，他們確定編碼V區(qū)和編碼C區(qū)的核酸序列肯定在同一條mRNA上，從而明確是同一個(gè)基因編碼V區(qū)和C區(qū)兩段氨基酸序列（Milstein et al.，1974）。
Leder進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MPOC41的Ig基因編碼C區(qū)的拷貝數(shù)只有2.7，但編碼V區(qū)的拷貝數(shù)在30至50之間（Leder et al.，1974），他們提出在DNA或者RNA水平，需要有迄今未知的機(jī)理，將編碼V區(qū)的部分與編碼C區(qū)的部分連起來。
英國(guó)科學(xué)家還用MOPC21骨髓瘤進(jìn)行分析推測(cè)V區(qū)和C區(qū)都只有幾個(gè)拷貝（Rabbits and Milstein，1975）。利根川進(jìn)純化λ和κ輕鏈的mRNA達(dá)到90%以上的純度，發(fā)現(xiàn)λ和κ輕鏈的DNA一樣拷貝數(shù)有限，再加上當(dāng)時(shí)已知的氨基酸序列，他推算約25種Vκ（或Vλ），不支持種系發(fā)生細(xì)胞學(xué)說（Tonegawa et al.，1976）。瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)科學(xué)家分析MPOC41骨髓瘤編碼輕鏈的基因完全沒有重復(fù)，重復(fù)由污染的DNA造成（Farace et al.，1976）。本庶佑等推測(cè)Vλ只有兩個(gè)拷貝（Honjo et al.，1976）。
1976年，小泉純一郎（Nobumichi Hozumi，1943-）和利根川進(jìn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單而巧妙的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胚胎期的Ig基因與成體Ig基因的差別（Hozumi and Tonegawa，1976）。他們用Balb/c衍生的MOPC321骨髓瘤純化其編碼Igκ輕鏈的mRNA，比較12、13天Balb/c鼠胚和MOPC321與之雜交的DNA（編碼κ輕鏈的DNA）。他們用限制性內(nèi)切酶BamH1將基因組DNA切成小段，然后看哪些片段可以雜交κ輕鏈mRNA所制備的放射性標(biāo)記的探針。他們將κ輕鏈的RNA探針分成全基因的探針和3’端的探針，因?yàn)镃區(qū)在3’端，所以這兩個(gè)探針的差別部分應(yīng)該是V區(qū)的信號(hào)。在胚胎中，κRNA探針可以雜交到兩個(gè)分子量分別為6.0和3.9百萬道爾頓的BamH1片段，其中6百萬道爾頓的片段只與全長(zhǎng)的κRNA探針雜交，不與3’的κRNA探針雜交，3.9百萬道爾頓的片段與全長(zhǎng)和3’的兩種κRNA探針都雜交，所以6百萬道爾頓的基因組BamH1片段應(yīng)該含V區(qū)和C區(qū)，而3.9百萬道爾頓的片段只含C區(qū)、不含V區(qū)。在MOPC321骨髓瘤中，利根川進(jìn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)2.4百萬道爾頓的BamH1片段與全長(zhǎng)和3’的兩種κRNA探針分別都雜交。他們的結(jié)果提示在胚胎中兩個(gè)不相連接的片段，而成熟的免疫細(xì)胞中成了一個(gè)片段，因此染色體發(fā)生了重組。他們認(rèn)為不會(huì)是因?yàn)榛蛐蛄凶兓檬チ薆amH1的酶切位點(diǎn)，因?yàn)槿绻ヒ粋€(gè)位點(diǎn)，長(zhǎng)度應(yīng)該是9.9而不是2.4百萬道爾頓。需要同時(shí)改變幾個(gè)BamH1切割位點(diǎn)的序列才能得到2.4百萬道爾頓的片段。以后他們換了限制性內(nèi)切酶也觀察到類似的變化，而且用λ輕鏈也觀察到類似變化（Tonegawa et al.，1977a）。Tonegawa討論了幾種V和C區(qū)基因重組的模型（Hozumi and Tonegawa，1976；Tonegawa et al.，1977a）。英國(guó)科學(xué)家用類似方法觀察到胚胎與骨髓瘤來源Ig基因的V區(qū)和C區(qū)有染色體重組，但以為V和C區(qū)即使在骨髓瘤仍并非緊鄰（Rabbits and Forster，1978）。
1973年，舊金山加州大學(xué)生物化學(xué)系的Herbert Boyer（1936-）和斯坦福大學(xué)微生物系的Stanley Cohen（1935-）發(fā)明重組DNA技術(shù)（Cohen et al.，1973）。DNA序列測(cè)定方法至1977年成功地建立（Wu，1972；Maxam and Gilbert，1977；Sanger, Nicklen and Coulson，1977）。
技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)了基因的分析。1977年，來源于12天鼠胚的Igλ輕鏈基因成為最早克隆的幾個(gè)基因之一（Tonegawa et al.，1977b），它含編碼V和C的部分。利根川進(jìn)實(shí)驗(yàn)室還克隆了HOPC2020骨髓瘤的λ輕鏈基因，也含編碼V和C的部分，用電子顯微鏡檢測(cè)雜交推算其Vλ和Cλ間隔1250堿基對(duì)（Brack and Tonegawa，1977）。Leder實(shí)驗(yàn)室克隆了MOPC149骨髓瘤的兩種Vκ基因的DNA，發(fā)現(xiàn)可能有多種序列有差別的Vκ基因（Seidman et al.，1978）。利根川進(jìn)實(shí)驗(yàn)室克隆了全長(zhǎng)的胚胎來源的λ輕鏈基因和HOPC2020來源的λ輕鏈基因，通過電鏡等分析確定V和C在淋巴細(xì)胞分化過程中應(yīng)該有重組。重組應(yīng)該發(fā)生在V和C之間的J序列，實(shí)際為V-J重組（Brack et al.，1978）。Leder實(shí)驗(yàn)室分析了22種κ鏈的J序列，胚胎不僅有多個(gè)Vκ序列也有多個(gè)Jκ序列，在淋巴細(xì)胞成熟過程中，其中一個(gè)Vκ、一個(gè)Jκ經(jīng)過V-J的連接被選擇，但他們當(dāng)時(shí)不確定其機(jī)理是DNA重組還是RNA剪接（Weigert et al.， 1978）。利根川進(jìn)實(shí)驗(yàn)室再克隆和分析鼠胚全部Jκ序列，其中有5個(gè)不同的Jκ序列，而成熟后漿細(xì)胞只有一個(gè)Jκ序列，他們分析認(rèn)為在染色體V-J重組過程中，其間的序列失去而被選擇的Vκ與Jκ連接（Sakano et al.，1979）。Leder實(shí)驗(yàn)室也有類似結(jié)論（Seidman, Max and Leder P，1979）。
1980年，加州理工學(xué)院的Hood實(shí)驗(yàn)室、回日本東京大學(xué)的本庶佑實(shí)驗(yàn)室、Basel免疫研究所的利根川進(jìn)實(shí)驗(yàn)室確定淋巴細(xì)胞成熟過程中Ig基因發(fā)生了兩次重組，一次是編碼V區(qū)的部分與編碼J序列的部分（V-J），一次是編碼J序列的與編碼C區(qū)的部分（J-C，亦稱class switching）（Davis et al.，1980；Kataoka et al.，1980；Sakano et al.，1980）。利根川進(jìn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在重鏈的J序列前面還有一段D（diversity）序列，一共有8種，所以還有V-D重組（Kurosawa and Tonegawa，1982）。
1983年，利根川進(jìn)總結(jié)體細(xì)胞染色體重組如圖。
染色體重組的多樣性是Ig序列多樣性的一個(gè)重要來源。人的抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。人的14號(hào)染色體編碼Ig重鏈基因，由2號(hào)染色體編碼κ輕鏈，22號(hào)染色體編碼λ輕鏈。功能性重鏈基因片段包含46種V區(qū)段、23種D區(qū)段、6種J區(qū)段。功能性κ輕鏈有33種可能的V、5種J，無D區(qū)段。功能性λ輕鏈基因有33種V、5種J，無D區(qū)段。每一個(gè)抗體來自這些的組合，至少有5x1013種可能。這不僅是B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體多樣性的機(jī)理，也是T淋巴細(xì)胞表面受體的多樣性機(jī)理，人的T細(xì)胞受體因此可以有約1018種可能的組合。
重組激活基因的發(fā)現(xiàn)
Ig基因重組的分子機(jī)理在于重組酶。
1984年，分子生物學(xué)家David Baltimore（1938-）當(dāng)時(shí)在MIT實(shí)驗(yàn)室的研究生Susanna Lewis設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)，用κ輕鏈基因的部分序列重構(gòu)V-J重組。他們選取了鼠胚Vκ和Jκ及其附近的DNA序列，裝在病毒里面。將這種病毒感染淋巴細(xì)胞樣的體外培養(yǎng)細(xì)胞系PD。他們?cè)谛蛄蠽κ和Jκ之間，裝了來自細(xì)菌的可以產(chǎn)生對(duì)霉酚酸起抵抗性的黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase，gpt）。因?yàn)轭A(yù)計(jì)重組導(dǎo)致其間DNA序列翻轉(zhuǎn)，所以放到病毒的是反向的gpt序列。一旦發(fā)生Vκ和Jκ之間重組，其間的序列翻轉(zhuǎn)，gpt成為正向而可以表達(dá)GPT蛋白質(zhì)，細(xì)胞能夠抵抗霉酚酸。Lewis等成功地觀察到，她們的分子構(gòu)造，轉(zhuǎn)染入PD細(xì)胞系后，經(jīng)過霉酚酸后得到的細(xì)胞株多數(shù)都是因出現(xiàn)了Vκ和Jκ之間DNA重組、gpt序列翻轉(zhuǎn)（Lewis et al.，1984）。
Baltimore實(shí)驗(yàn)室的另一位研究生David Schatz用類似Lewis的方法，再構(gòu)建了一個(gè)含B潮霉素抗性基因（hph）的病毒。用兩種病毒，他們檢驗(yàn)了多種B細(xì)胞前體細(xì)胞樣的細(xì)胞系，多數(shù)能夠重組Vκ和Jκ之間DNA、翻轉(zhuǎn)gpt或hph抗性基因序列，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)霉酚酸或B潮霉素有抵抗性。但如果用同樣的病毒感染3T3成纖維細(xì)胞系，就不能發(fā)生Vκ和Jκ之間DNA重組（Schatz and Baltimore，1988）。Schatz在實(shí)驗(yàn)室周會(huì)上講自己工作進(jìn)展時(shí)，以色列來的博士后Yoav Citri（1953-1995）建議想辦法激活3T3細(xì)胞中的V（D）J重組活性，這一建議影響了后面的研究（Schatz and Baltimore，2004）。
要在3T3細(xì)胞發(fā)生Vκ和Jκ之間DNA重組，當(dāng)時(shí)一般的設(shè)計(jì)應(yīng)該是把可重組Vκ-Jκ的細(xì)胞（前B細(xì)胞）的mRNA做成cDNA文庫。文庫的大量不同cDNA轉(zhuǎn)染到3T3細(xì)胞，后者含有可以檢測(cè)Vκ和Jκ之間DNA重組的gpt或hph。在沒有轉(zhuǎn)染來自前B細(xì)胞cDNA的情況下，3T3細(xì)胞會(huì)被霉酚酸或B潮霉素殺死。而如果有前B細(xì)胞的cDNA導(dǎo)致Vκ和Jκ之間DNA重組，使得其間的gpt或hph基因成為可以表達(dá)的方向，從而有GPT或HPH合成，這樣的3T3細(xì)胞就能抵抗霉酚酸或B潮霉素。多數(shù)3T3細(xì)胞都被轉(zhuǎn)染了來自表達(dá)不能起重組酶作用的cDNA，這些3T3細(xì)胞會(huì)被霉酚酸或B潮霉素殺死，剩下可抵抗霉酚酸或B潮霉素的3T3細(xì)胞就很可能是表達(dá)了可以導(dǎo)致Vκ和Jκ之間DNA重組的重組酶的cDNA。
因?yàn)橐环N細(xì)胞表達(dá)很多mRNA從而可以得到很多不同的cDNA，如果是一種cDNA編碼重組酶，那么這種方法一般是可行的。但是，如果是多種cDNA編碼的蛋白質(zhì)才能引起Vκ和Jκ之間DNA重組，那么同時(shí)含有兩種或多種起作用的cDNA的幾率就會(huì)很小。Baltimore當(dāng)時(shí)在Whitehead研究所的同事Robert Weinberg（1942-）用分子生物學(xué)研究癌癥，Weinberg實(shí)驗(yàn)室用基因組DNA制備文庫。將這種文庫轉(zhuǎn)染到3T3細(xì)胞時(shí)，每個(gè)3T3被轉(zhuǎn)染的不會(huì)只是單個(gè)cDNA，而是一段基因組DNA，如果基因組DNA含相鄰幾個(gè)基因的時(shí)候，就可能是幾個(gè)基因。
Schatz把B淋巴瘤的基因組DNA轉(zhuǎn)染到3T3，基因組DNA接了一種抗性基因（組氨醇脫氫酶），首先用這種抗性基因針對(duì)的藥物（組氨醇）選擇被B淋巴瘤的基因組DNA轉(zhuǎn)染了的3T3細(xì)胞。然后用霉酚酸選擇發(fā)生了V-J重組的3T3細(xì)胞。他們從1500個(gè)抵抗組氨醇的3T3細(xì)胞克隆得到1個(gè)抗霉酚酸的3T3細(xì)胞株（Schatz and Baltimore，1988）。他們分析發(fā)現(xiàn)這一3T3細(xì)胞株確實(shí)出現(xiàn)了Vκ和Jκ之間DNA重組，使得其間的gpt表達(dá)，而不是其他原因?qū)γ狗铀岢霈F(xiàn)抵抗。但很多人不信，他們附近的實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為他們的結(jié)果不可靠、發(fā)表的是偽跡（Schatz and Baltimore，2004）。
Schatz與研究生Marjorie Oettinger組成兩人合作，每天倒班、想方設(shè)法克隆重組激活基因（RAG）。他們用特定的寡核苷酸標(biāo)記基因組的DNA，從出現(xiàn)重組的細(xì)胞中通過用于標(biāo)記的寡核苷酸取得基因組DNA片段，以此克隆了RAG的催化亞基RAG-1（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。RAG-1基因編碼含一千余氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其同源基因存在于有V（D）J重組的動(dòng)物如人、鼠、兔、羊、馬、雞、蛙。在人和鼠能夠進(jìn)行V（D）J重組的細(xì)胞系，RAG-1也有表達(dá)。RAG-1表達(dá)于鼠的胸腺、骨髓和胚胎，而不在脾臟和腦表達(dá)。所以RAG-1表達(dá)的細(xì)胞和組織也與V（D）J重組活性相關(guān)。
在一派大好的形勢(shì)下，有個(gè)異數(shù)：含RAG-1基因的18kb DNA，催化V（D）J重組的活性居然與最初全基因組切的片段效率一樣，比預(yù)計(jì)的低100到1000倍。當(dāng)時(shí)他們的估計(jì)是也許因?yàn)樗玫幕蚪MDNA不夠長(zhǎng)，缺乏某些未知的轉(zhuǎn)錄控制元件和34個(gè)氨基酸（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。但她們發(fā)現(xiàn)，得到全長(zhǎng)的cDNA后，活性也不高（Oettinger et al.，1990）。他們經(jīng)過幾個(gè)月的迷惑不解，不斷提各種可能。其中一個(gè)比較難以置信的可能性是RAG-1旁邊碰巧還有一個(gè)基因，與它共同起作用（Schatz and Baltimore，2004）。在細(xì)菌中，已知相關(guān)功能的基因聚集在附近，而動(dòng)物細(xì)胞的基因早已知道并非如此。
她們發(fā)現(xiàn)在原初有重組活性的18kb基因組DNA中，RAG-1基因只占其中6.6kb，另有11kb，余下的基因組DNA中還有一個(gè)基因。她們進(jìn)一步的工作證明這個(gè)基因可以提高RAG-1重組效率1000倍，因此她們稱這一基因?yàn)镽AG-2（Oettinger et al.，1990）。以后知道，RAG-1獨(dú)立進(jìn)化自轉(zhuǎn)座酶Transib，后來又捕獲了RAG-2基因進(jìn)一步增強(qiáng)其活性，之后RAG-1和RAG-2的序列和功能變化成為專門用于Ig基因重組的酶（Carmona and Schatz，2017）。
結(jié)語
哺乳動(dòng)物體液免疫的主力為B淋巴細(xì)胞，它們?cè)谂咛テ陂g受到“馴化”，是區(qū)別自我和非我是產(chǎn)生免疫耐受的一種方式：凡是胚胎期接觸頻繁的已有抗原被認(rèn)為是自身抗原，識(shí)別自身抗原的新成熟B細(xì)胞在骨髓中被抑制或被誘導(dǎo)死亡，剩下的細(xì)胞識(shí)別外來（或體內(nèi)以后異常而產(chǎn)生）的抗原。還有其他產(chǎn)生免疫耐受的方式。
抗體是蛋白質(zhì)，哺乳動(dòng)物中除駱駝科動(dòng)物抗體缺少輕鏈外，抗體一般由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。它們有結(jié)合抗原的變異V區(qū)，和恒定的C區(qū)。在幼稚B細(xì)胞，編碼V區(qū)的有多個(gè)序列，還有多個(gè)J序列，和有限的C區(qū)。在重鏈還有位于J序列的N端的多個(gè)D序列。由染色體V（D）J重組導(dǎo)致特定的一種V序列與特定的一種D和/或J序列連接，重組的產(chǎn)物作為一個(gè)外顯子與C區(qū)一起表達(dá)成熟的Ig基因。因?yàn)橹亟M過程中選擇和組合的多種可能而提供抗體的多樣性。此外，V（D）J重組過程中連接位點(diǎn)處序列的多樣性還可以得到增加：DNA斷裂位點(diǎn)連接之前的加工、處理，如堿基的隨機(jī)篩除（deletion），P序列增加（P Nucleotide Addition），由末端轉(zhuǎn)移酶（terminal dideoxy transferase, TdT）介導(dǎo)的N序列增加（non-template nucleotides addition）（Alt and Baltimore，1982；Desiderio et al.，1984）。
最初在B細(xì)胞表達(dá)的是膜結(jié)合的抗體Ig與2個(gè)跨膜蛋白Igα、Igβ組成的B細(xì)胞受體（BCR）（Raff, Steinberg and Taylor，1970）。BCR受抗原刺激后，通過Igα和Igβ將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給細(xì)胞內(nèi)，刺激B細(xì)胞增殖和分化成熟，包括基因突變和選擇，抗體親和力提高，成為漿細(xì)胞或記憶細(xì)胞。一旦再次得到抗原刺激，快速分泌抗體Ig。
除體細(xì)胞重組之外，Ig序列多樣性還有一個(gè)來源：體細(xì)胞高頻突變（somatic hypermutation）。在V（D）J外顯子區(qū)，特別是其與抗原結(jié)合的區(qū)域，特異酶催化單個(gè)堿基突變。體細(xì)胞基因突變，最早由Lederberg提出（Lederberg，1959），Brenner和Milstein進(jìn)一步提出抗原結(jié)合區(qū)域的突變頻率可能高于其他序列（Brenner and Milstein，1966）。蛋白質(zhì)序列分析（Weigert et al., 1970）和基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)確實(shí)有體細(xì)胞突變（Bernard，Hozumi and Tonegawa，1978；Brack et al.,1978），而且淋巴細(xì)胞接觸抗原時(shí)間越長(zhǎng)、其Ig基因變異越多（Griffiths et al.，1984；Berek and Milstein，1987）。體細(xì)胞高突變的機(jī)理是活化誘導(dǎo)的脫胺酶（activation-indued deaminase，AID），它催化脫氧胞嘧啶脫胺，堿基變化及其修復(fù)導(dǎo)致Ig序列多種變化（Di Noia and Neuberger，2007；Teng and Papavasiliou，2007；Peled et al., 2008）。
免疫與疾病有雙重的密切關(guān)系。免疫過低導(dǎo)致罹患感染、增加癌癥的可能，免疫過強(qiáng)導(dǎo)致過敏反應(yīng)和自身免疫性疾病。
免疫學(xué)研究不僅加深了人類對(duì)于免疫學(xué)原理的理解，也帶來了超出免疫學(xué)應(yīng)用的技術(shù)。放射免疫檢測(cè)（Radioimmunoassay，RIA）（Yalow and Berson，1960）和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（Engvall and Perlmann，1971）用于定量檢測(cè)微量分子。流式細(xì)胞檢測(cè)（flow cytometry）、也稱熒光激活細(xì)胞分離器（fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS）可以根據(jù)表面抗原和其他差異化的分子標(biāo)記而分離多種細(xì)胞?？寺∵x擇學(xué)說的直接應(yīng)用誕生了單克隆抗體技術(shù)，它不僅可以用于檢測(cè)、而且可以用于治療（K?hler and Milstein，1975）。免疫學(xué)原理和技術(shù)也有助于理解和治療非免疫系統(tǒng)的疾?。ㄈ绨┌Y的診斷和治療）。
注1：1901年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)為什么只給了von Behring而不包括北里，討論的文章如：Kantha（1991）。本章涉及的免疫學(xué)工作獲諾獎(jiǎng)的：Emil von Behring（1901）、élie Metchnikoff（1903）、Paul Ehrlich（1909）、Jules Bordet（1919）、Karl Landsteiner（1930）、Frank Macfarlane Burnet（1960）、Peter Medawar（1960）、Rosalyn Yalow (1977)，Niels Jerne（1984）、Rodney Porter（1972）、Gerald Edelman（1972）、Susumu Tonegawa（1987）。微生物學(xué)家科霍（Robert Koch）因其研究病原菌而獲獎(jiǎng)（1905），分子生物學(xué)家Joshua Lederberg因研究細(xì)菌的遺傳學(xué)而獲獎(jiǎng)（1958），分子生物學(xué)家David Baltimore因發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶獲獎(jiǎng)（1975），César Milstein因發(fā)明單克隆抗體技術(shù)獲獎(jiǎng)（1984）， Oliver Smithies以后因發(fā)明基因敲除技術(shù)獲獎(jiǎng)（2007），本庶佑以后因?qū)δ[瘤免疫的貢獻(xiàn)獲獎(jiǎng)（2018）。
注2：英國(guó)Richard Lower的輸血實(shí)驗(yàn)，1666年由他的同學(xué)Robert Boyle (1627-1691)提交皇家學(xué)會(huì)，并有Boyle的提問和建議 (Boyle，1666)。他們都是“牛津?qū)嶒?yàn)哲學(xué)俱樂部”的成員。
注3：在博士論文中，Ehrlich發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞（Ehrlich，1878）。在Charité醫(yī)院期間，他通過染色發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞（Ehrlich，1891a）。他還研究了貧血和白血病，并參與主編《貧血》一書。因?yàn)镋hrlich在血液學(xué)的科學(xué)發(fā)現(xiàn)和技術(shù)發(fā)明，科學(xué)史家稱其為“血液學(xué)之父”（Wintrobe，1985）。
注4：Pfeiffer現(xiàn)象有兩方面意義，其二是發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素的起點(diǎn)。他發(fā)現(xiàn)加熱之后的霍亂弧菌還有毒性，所以提出細(xì)菌的細(xì)胞被破壞后，釋放了對(duì)熱不敏感的毒素。
注5：Landsteiner當(dāng)時(shí)有沉重的病理解剖任務(wù)，1897年至1907年他做過3639次。在這樣的情況下，他發(fā)表了75篇論文（52篇血液學(xué)、12篇細(xì)菌學(xué)、11篇病理解剖學(xué)）。他有多項(xiàng)科學(xué)發(fā)現(xiàn)，除了血型之外，他于1909年與Erwin Popper醫(yī)生（1879-1955）發(fā)表他們對(duì)脊髓灰質(zhì)炎的研究，他們?cè)?908年11月到12月的實(shí)驗(yàn)成功地將脊髓灰質(zhì)炎從患者兒童引入猴，對(duì)發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒起了很大作用。脊髓灰質(zhì)炎不能感染小鼠、豚鼠、或兔子，但可以感染猴，并且發(fā)病類似人。Landsteiner的血型研究，始于1900年文章的注腳，其后他經(jīng)常引用文章的頁碼是注腳出現(xiàn)的361頁，而不是全文的頁碼。他移民美國(guó)后在洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所工作，還發(fā)現(xiàn)了Rh血型（Landsteiner and Wiener，1940）。
注6：在Belfanti and Carbone（1898）的基礎(chǔ)上，Bordet（1899）和Ehrlich and Morgenroth（1900b）提出了補(bǔ)體（complement）的功能及其機(jī)理。Bordet稱補(bǔ)體為alexin, Ehrlich曾稱補(bǔ)體為addiment?？贵w一個(gè)位點(diǎn)與紅細(xì)胞結(jié)合，另一位點(diǎn)與補(bǔ)體結(jié)合。在本章所涉及的實(shí)驗(yàn)中，凝集反應(yīng)無需補(bǔ)體，溶血反應(yīng)需要補(bǔ)體。
注7：當(dāng)時(shí)所謂凝集紅細(xì)胞的凝集素，后來知道一般是IgM，人和鼠的IgM有五個(gè)亞基，可結(jié)合多個(gè)紅細(xì)胞，從而造成凝集。
注8：英國(guó)醫(yī)生、微生物學(xué)家Charles Todd（1869-1957）因?yàn)榘＜俺霈F(xiàn)每天死上千頭牛的牛瘟而于1904年到開羅工作。1910年6月，他在皇家學(xué)會(huì)宣讀論文（Todd and White，1910a），此后發(fā)表全文（Todd and White，1910b）。他們的研究基于Ehrlich and Morgenroth（1900a）用豚鼠做的實(shí)驗(yàn)。Todd和White用106頭牛的血清和紅細(xì)胞在體外做研究。他們發(fā)現(xiàn)：與豚鼠一樣，每頭牛的血清不會(huì)對(duì)自己的紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)，而會(huì)溶解一些其他牛的紅細(xì)胞。但如果事先將一頭牛的血清用另外一頭牛（A）的紅細(xì)胞進(jìn)行共育一小時(shí)，然后再檢測(cè)這種血清，它不再溶A牛（和一些牛）的紅細(xì)胞，但繼續(xù)溶解其他一些牛的紅細(xì)胞。他們稱之為“耗竭”（exhaustion）。他們當(dāng)時(shí)著重于牛的個(gè)體識(shí)別，而實(shí)際也給免疫耐受的理解埋下了伏筆。雖然免疫耐受是在細(xì)胞水平--而不是抗體分子水平--的去除。
注9：Burnet于1929年發(fā)現(xiàn)第二次免疫反應(yīng)大于第一次，但這一結(jié)果被英國(guó)醫(yī)學(xué)雜志拒稿，他后來講其發(fā)表于1941年無需同行評(píng)審的研究所發(fā)行的單行本中的結(jié)果（Burnet et al.，1941）。他發(fā)表于1956年的書顯然是1955年寫作時(shí)還沒有Jerne的文章。Burnet對(duì)澳大利亞的科學(xué)有很大影響，1957年他決定將Walter and Eliza Hall研究所全部集中研究免疫學(xué)，使之長(zhǎng)期成為國(guó)際免疫學(xué)研究重鎮(zhèn)。
注10：Gustav Nossal的曾祖父母是猶太人，因此其家庭也在希特勒時(shí)代被迫離開維也納移民澳大利亞。他從醫(yī)學(xué)院畢業(yè)后，對(duì)病毒研究很感興趣，1957年被推薦到Burnet實(shí)驗(yàn)室讀研究生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Burnet“轉(zhuǎn)行”全部研究免疫，不再研究病毒，非常驚訝，非常不情愿。為了做實(shí)驗(yàn)，他讀了文獻(xiàn)，特別注意到即將從美國(guó)來其所在澳大利亞研究所訪問的Joshua Lederberg的方法可以用于自己的研究。
注11：Joshua Lederberg因研究細(xì)菌間的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移而獲1958年諾貝爾獎(jiǎng)。他當(dāng)年已到澳大利亞與Burnet實(shí)驗(yàn)室合作，后從Wisconsin搬到Stanford創(chuàng)辦遺傳學(xué)系。
文章頭圖及封面圖片來源：imperial.ac.uk
