揭秘溫感和觸覺，人類與客觀世界的再握手
本文將解讀2021年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎：溫度和觸覺感受器的發(fā)現(xiàn) | 圖源：pixabay.com
如果細數(shù)諾貝爾獎歷史，你就會發(fā)現(xiàn)對感覺系統(tǒng)的探索一直頗受諾獎的青睞，1914年內(nèi)耳羅伯特·巴拉尼在前庭器官的生理和病理方面的工作，1967年瓦爾德對視黃醛參與視覺形成機制的詮釋，2004年理查德·阿克塞爾和琳達·巴克對人體氣味受體和嗅覺系統(tǒng)組織方式的研究…… 每一種感覺的揭秘，都是人類與客觀世界一次意義重大的握手。
今日文章，將深入解讀2021年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎工作：溫度和觸覺感受器的發(fā)現(xiàn)。
撰文｜付小雨 褚劉薇 沈偉（上?？萍即髮W生命科學與技術(shù)學院）
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人類如何感知、理解和重建外部世界？從新生兒第一次睜開雙眼，聽到母親第一聲溫柔的呼喚開始，龐大而精妙的感覺系統(tǒng)就開始一刻也不停歇地運作起來，讓我們得以欣賞美景，嗅聞花香，聆聽音樂，品嘗美食。
圖1 感覺系統(tǒng)原理圖（褚劉薇）
2021年10月4日，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎宣布授予美國研究者大衛(wèi)·朱利葉斯（David Julius）和阿登·帕塔普蒂安（Ardem Patapoutian），以獎勵他們關于 “發(fā)現(xiàn)溫度和觸覺受體” 的突破性成就，在人類理解自身與外部世界交互的歷史上寫下了彌足輕重的一筆。
今天，我們就來談談這兩種分別源于 “能嘗出辣味的細胞” 和 “失去觸覺的細胞” 的非典型感覺受體的發(fā)現(xiàn)。
能嘗出辣味的細胞
人們滿頭大汗，齜牙咧嘴，卻仍然不斷地把筷子伸進漂浮著辣椒的通紅火鍋，邊吃邊直喊 “辣得爽”。“辣” 為何讓他們著迷？“辣-熱-痛” 之間到底存在什么樣的神秘聯(lián)系？“辣”能夠為人類與客觀世界交互打開什么樣的獨特窗口？
圖2 人們在吃辣時會感到痛和熱 | 褚劉薇
“辣” 的故事，要從一只 “失明” 的果蠅講起。1969年，在愛丁堡大學這所有著500多年歷史的古老大學里，動物學系的兩名研究者 D. J. Cosens 和 Aubrey Manning 正忙碌著觀察一只 “失明” 的果蠅。這只果蠅，基因發(fā)生了突變，病癥十分奇特，在低環(huán)境光下有著像正常果蠅一樣的趨光性，但當給予連續(xù)光刺激時，卻表現(xiàn)出失明癥狀，無法像正常果蠅一樣調(diào)整姿勢而趨向有光的一側(cè)，只能毫無方向、跌跌撞撞地飛行。在醫(yī)院里，醫(yī)生通常用心電圖儀監(jiān)測病人心臟。而在實驗室里，兩位研究者利用神經(jīng)場電位記錄技術(shù)（filed potential）監(jiān)測這只生病的果蠅的視網(wǎng)膜。果然，在視網(wǎng)膜電流圖（ERG）的記錄中，他們發(fā)現(xiàn)這只突變體果蠅表現(xiàn)出了畸形的樣式，不能像野生型那樣在受到光刺激時維持持久的視網(wǎng)膜電位變化（圖3）[1]。隨后，根據(jù)視網(wǎng)膜電流圖中出現(xiàn)的瞬時電位的特征，這個突變基因被命名為trp（transient receptor potential）[2]。
圖3 TRP突變體果蠅視網(wǎng)膜電流圖 [1] 注：A，30s連續(xù)光照下野生型果蠅視網(wǎng)膜電流；B，30s連續(xù)光照下TRP突變體果蠅無法維持持久的視網(wǎng)膜電位變化。
不過隨后十幾年的時間里，受分子生物學的發(fā)展所限，始終不見關于trp 基因的新研究。直到20世紀80年代生物學進入風起云涌的基因克隆時代，才有相關的研究進展。當時，美國加州大學伯克利分校 Gerald Rubin 實驗室的博士后 Craig Montell 利用該實驗室剛剛開發(fā)出的果蠅轉(zhuǎn)基因技術(shù) [3,4]，將疑似含有trp 的DNA片段通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導入 “失明” 果蠅的基因組，“失明” 癥狀果然消失了 [5]。隨后，他又利用分子生物學克隆出了trp 的DNA序列，并預測這可能是一個離子通道蛋白基因 [6]（圖4）。
圖4 挽救trp基因突變性狀trp基因的克隆 [5,6] 注：左，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使trp基因突變果蠅可以重新維持持久的視網(wǎng)膜電位變化；右上，對突變等位基因trp的RNA分析；右下，TRP蛋白預測結(jié)構(gòu)。
隨著基因組學的發(fā)展，人們很快發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中有超過30個TRP通道家族成員，包含7個亞族 [7]。但是這些蛋白到底有什么生理作用呢？是否具有保守的視覺傳導功能？在上個世紀末這一切都還是未知的，直到本次諾獎得主加州大學舊金山分校（UCSF）的朱利葉斯成功克隆辣椒素受體，才掀起了TRP研究的熱潮?，F(xiàn)在人們知道，TRP家族蛋白不僅參與光感應，還感應溫度和刺激性化學物質(zhì)，并參與腫瘤遷移等，具有非常豐富的生物學功能。
朱利葉斯自研究生時代就對植物的天然產(chǎn)物，如辣椒素、薄荷醇、芥末等等，是如何被人類感知的充滿巨大的好奇。他說，“當我走在超市里，貨架上一排排辣椒醬簡直是在乞求我去探索它們被感知的奧秘?！?1990年代后期，他進行了一項鑒定辣椒素受體的項目?；谏鲜兰o中葉科學家們對辛辣食物時會產(chǎn)生灼燒感這一現(xiàn)象的關注，朱利葉斯認為了解辣椒素的作用可以提供對疼痛信號的深入了解。
值得一提的是，朱利葉斯的博士和博士后導師均為諾獎獲得者。其博士導師之一 Randy Schekman（另一位為Jeremy Thorner）因揭示突觸傳導機制而獲獎；其博士后導師 Richard Axel 因克隆嗅覺受體而獲獎。Julies在博后期間通過表達克隆與電生理分析相結(jié)合的方式，成功分離出了編碼5-羥色胺受體1C的基因（圖5）[8]。這為他后期克隆辣椒素受體奠定了基礎。
圖5 5-羥色胺受體1c的表達克隆[8]
朱利葉斯在UCSF獲得獨立教職后，決定與博士后研究員 Michael J. Caterina 采用他博后期間開發(fā)的這套克隆方法，對辣椒素受體進行無偏見的功能篩選，其假設是單個基因可以在通常對辣椒素不敏感的細胞中賦予辣椒素敏感性。為了找到這個假定的基因，Julius和同事從嚙齒動物背根神經(jīng)節(jié)——其中包含辣椒素激活的感覺神經(jīng)元的細胞體——中制作了一個cDNA文庫。用這些cDNA批次轉(zhuǎn)染對辣椒素不敏感的細胞，期待最終找到能 “嘗出辣味” 的單個cDNA克隆?？墒羌毎粫f話，科學家是怎么知道它們能嘗出辣來呢？幸好，有鈣成像這項強大的技術(shù)。鈣成像技術(shù)是指利用鈣離子指示劑（如Fura2等）監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子濃度的方法，允許細胞使用熒光強度作為自己的語言。有了這項技術(shù)，原本悄無聲息的離子濃度變化就變成了一幅可視影像。
經(jīng)過兩三年對實驗技術(shù)的艱難摸索，Caterina和Julius驚喜地發(fā)現(xiàn)，加入辣椒素后，一盤原本在顯微鏡視野里毫無波瀾的細胞開始閃爍，像黑夜里的星星一般散發(fā)出迷人的光芒（圖6，A）。這正是上面所提到的TRP蛋白家族的一員——TRPV1蛋白的功勞 [9]：辣椒素與V1受體（當時被叫做V1）結(jié)合，打開離子通道，引起鈣離子胞內(nèi)濃度的迅速增加。Caterina和Julius還發(fā)現(xiàn)，TRPV1通道也能被高溫激活而開放，其激活閾值為~40°C，接近熱痛的心理物理閾值。此外，為了證明TRPV1蛋白自身可被熱刺激激活，Julius實驗室將純化后的TRPV1蛋白重構(gòu)于人工脂質(zhì)體上，發(fā)現(xiàn)其仍然具有溫度感受功能 [10]。于是，TRPV1的發(fā)現(xiàn)完美的解釋了為何吃辣椒總是感到熱的現(xiàn)象。至此，一個由好奇心驅(qū)動的研究，意外揭開了TRP蛋白在哺乳動物中功能的神秘面紗。
圖6 辣椒素受體TRPV1的發(fā)現(xiàn) [9] 注：A，用cDNA克隆庫轉(zhuǎn)染的HEK293細胞。在DRG-11池中，一些細胞對辣椒素有反應。經(jīng)過反復試驗，鑒定了一個對應于TPRV1(VR1)的克?。籅，表達VR1的卵母細胞對辣椒素(10 M)和四種辣椒提取物的反應
在生理意義上，TRPV1作為唯一被辣椒素激活的受體的作用及其在轉(zhuǎn)導辣椒素的傷害性、炎癥和高熱效應方面的重要作用，在小鼠中得到證實。缺乏Trpv1 基因的動物僅表現(xiàn)出對急性傷害性熱刺激的痛覺反應下降，并降低了對炎癥性痛覺過敏（hyperalgesia）的熱敏感性 [11]。不過，Trpv1 的缺乏并沒有導致這些感覺完全消失，說明必然有其他熱敏蛋白存在?？茖W家把目光轉(zhuǎn)向其他TRP通道蛋白，最終在18年之后鑒定出TRPM3和TRPA1與TRPV1共同介導了傷害性熱刺激的感受 [12-14]。
最初尋找辣椒素受體的時候，人們并沒有想到它同時是感受熱的受體，在這一關聯(lián)建立之后，Julius實驗室對被視作清涼劑的薄荷醇的受體克隆充滿信心。果然，Julius實驗室和此次另一位諾貝爾獎得主Ardem Patapoutian實驗室在2002年分別獨立發(fā)現(xiàn)了薄荷醇的受體TRPM8，并證明這個TRP通道是寒冷的感覺傳感器 [15,16]。Trpm8 缺失會導致小鼠對無害寒冷感覺的明顯缺失 [17-19]。這些研究說明在進化上TRP通道具有通用的溫度感受作用，并在果蠅、線蟲、蚊子、蛇等多種動物中得到了驗證 [7,20]。
圖7 熱刺激與冷刺激感受器及對應的激動劑 | 褚劉薇
生物分子的結(jié)構(gòu)對闡明結(jié)構(gòu)與功能關系及藥物開發(fā)至關重要，TRPV1結(jié)構(gòu)的解析由Julius和程亦凡實驗室在2013年合作通過冷凍電子顯微鏡解析 [21,22]，是第一個通過冷凍電鏡解析的膜蛋白結(jié)構(gòu)。從冷凍電鏡結(jié)果上看，TRPV1有兩個控制離子通過的位點，在陽離子傳導孔的兩端形成兩個突出的物理結(jié)構(gòu)，辣椒素的結(jié)合位點位于靠近細胞質(zhì)側(cè)的膜深處的口袋。最近的一項結(jié)構(gòu)研究表明，有害熱量會在辣椒素結(jié)合的TRPV1 通道中產(chǎn)生兩種構(gòu)象門控轉(zhuǎn)變：第一個過渡態(tài)為通道打開做好準備，而第二個過渡態(tài)導致通道打開 [23]。TRPV1通道的結(jié)構(gòu)研究提供了對其離子滲透、配體識別和門控機制的重要見解，但尚未完全解釋其熱激活機制。
以TRPV1 通道為代表的溫度感受器的發(fā)現(xiàn)，不僅在基礎生理理解上有突破性的意義，也為開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物提供了靶點。除了作為疼痛感受器，TRP通道也在呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病如哮喘、心衰等方面發(fā)揮關鍵作用，在前列腺癌等多種癌癥以及中風、皮膚病等多種疾病中被報道有所參與。目前靶向TRPV1和TRPM8等離子通道蛋白的鎮(zhèn)痛小分子化合物，已有多個在進行臨床試驗 [24]。國內(nèi)科學家浙江大學楊巍、郭江濤、楊帆，南昌大學張進等在TRP通道的結(jié)構(gòu)研究和藥物研發(fā)上取得很多成果 [25-31]。
失去觸覺的細胞
如前所述，Ardem Patapoutian 作為寒冷感受器TRPM8的共同發(fā)現(xiàn)者，活躍在感覺受體研究領域。值得一提的是，這位出生于黎巴嫩的亞美尼亞裔美國神經(jīng)科學家，經(jīng)歷比Julius坎坷許多。他在戰(zhàn)火的陰影下生活了19年后，于1986年移居美國，輾轉(zhuǎn)之后于1990年獲得加州大學洛杉磯分校細胞與發(fā)育生物學學士學位，就此開啟了他此前未敢想象的科學家生涯。他不滿足僅僅是跟蹤者的角色，決定挑戰(zhàn)更加復雜的人類的機械力感受機制。
機械力感受無處不在。路人的摩肩接踵，來自朋友的擁抱，戀人之間的肌膚相親，父母落在孩童額上的吻，新冠疫情期間的隔離，讓很多人意識到這些原本司空見慣的來自他人的 “機械力” 彌足珍貴；當我們困在鋼筋森林，拂面的清風，滴落在手心的雨點，粗糙的樹干和嬌嫩的花瓣，大自然給予我們的 “機械力” 也變得令人想念。然而，感知機械力對我們的重要性遠遠不止這些。我們身體也在每時每刻給予自己機械力——站立、行走、排尿、血壓、呼吸、細胞分化運動等等生理活動都與機械力感受有密不可分的關系，這也就意味著體內(nèi)幾乎所有細胞都有一定程度的感受機械力的能力。因此，很難找到一種原本對觸覺毫無響應的細胞，發(fā)現(xiàn)TRPV1的那套方法也就很可能行不通。對機械力感知受體的探索無疑是困難的，Patapoutian將其稱為 “房間里的大象”，重要卻無人敢碰。
面對這個艱巨的任務，Patapoutian與其博士后 Bertrand Coste 勇敢地做出了自己的嘗試，他們從一種小鼠神經(jīng)瘤母細胞（N2A）入手。當被移液管用極微小的力輕戳時，這種細胞會釋放一個可測量的電流。然后，Coste和Patapoutian依次敲除300多個候選基因，通過觀察哪批細胞突然失去了機械力敏感性，確定相關基因。經(jīng)過長時間不懈努力，最終確定清單上的72號候選基因具此功能（圖8）。他們把這個基因取名為Piezo1 ——在希臘語里是壓力的意思。由于與Piezo1 基因的相似性，課題組發(fā)現(xiàn)的第二個基因被命名為Piezo2 [32]。隨后，Coste和另外一個博士后肖百龍（現(xiàn)在清華大學任職）通過單通道膜片鉗證明這兩個蛋白的確是機械力敏感的離子通道 [33]。
圖8 通過在機械敏感細胞系中敲除候選基因來尋找機械感受受體| 圖源：nobelprize.org 注：上圖，當敲除的基因為機械感受受體時，機械力敏感的細胞將不會再產(chǎn)生電流；下圖，PIEZO通道蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。
PIEZO蛋白代表了一類全新的脊椎動物機械敏感通道，與之前已知的離子通道家族沒有任何相似之處。它們是迄今為止鑒定出的最大的跨膜離子通道亞基。肖百龍、Patapoutian、楊茂君、李雪明、Roderick MacKinnon等實驗室的工作揭示了PIEZO1和PIEZO2的高分辨率結(jié)構(gòu)，并表明這些通道形成具有中心離子傳導孔和三個外圍大型機械傳感螺旋槳形葉片的同三聚體結(jié)構(gòu) [34,35]，當對膜施加機械力時，彎曲的葉片變平并導致中心孔的開口，帶有彎曲葉片的螺旋槳狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的平面內(nèi)膜面積膨脹，從而感知到精細機械力 [36,37]。
然而，機械力打開中心孔的確切機制仍未完全了解。目前已經(jīng)知道的是，通過其機械敏感性，PIEZO通道在許多細胞類型中充當多功能機械傳感器，并將機械力轉(zhuǎn)換為電化學信號。Patapoutian很快確認了PIEZOs為哺乳動物體內(nèi)壓力感應的必需基因。他的研究表明，PIEZOs可形成離子通道，它們直接負責皮膚內(nèi)默克爾細胞（Merkel cells）和觸覺終端，以及本體感受器（感覺神經(jīng)末梢位于肌肉內(nèi)的感受器，可以感受身體在空間的位置、姿勢和運動并做出反應）的壓力感測 [38,39]（圖9）。PIEZOs還能通過分布在血管和肺部的神經(jīng)末梢感知壓力 [40]，并影響紅細胞體積、血管生理 [41-43]，引發(fā)多種人類遺傳疾病。PIEZOs的發(fā)現(xiàn)打開了力學生物學的大門，這是一個與生物學、工程學和物理學交叉的新興科學領域，側(cè)重于研究細胞和組織的物理作用力和力學特性的變化如何對健康和疾病造成影響。
圖9 默克爾細胞和感覺神經(jīng)元中的機械力轉(zhuǎn)導 [38-44]
注：A，左，實驗圖示。對一個分離培養(yǎng)的GFP標記的默克爾細胞進行全細胞膜片鉗記錄，同時用玻璃探針施加機械刺激。右，當Piezo2被在默克爾細胞中條件性敲除時，內(nèi)向電流消失（藍線）；B，左，皮膚-神經(jīng)連接示意圖。用玻璃電極刺激熒光標記的默克爾細胞，同時記錄來自與之相連的SA I纖維的動作電位。右，機械刺激又刺激探針到皮膚的距離來衡量。在0處（虛線），探針剛碰到皮膚；大于0時，探針使皮膚下陷。Piezo2被在默克爾細胞中條件性敲除后，SA I纖維不再持續(xù)發(fā)放。
結(jié) 語
Patapoutian在采訪里說，“正因為人們太視本體感覺為理所當然了，所以導致如此重要的問題近一二十年才被解答?！?然而一旦PIEZO2發(fā)生突變，其重要性就難以被忽視。PIEZO2缺乏綜合征患者的本體感覺、觸覺和振動顯著減弱。這會導致感覺性共濟失調(diào)、測距障礙、步態(tài)困難、肌肉無力和萎縮、脊柱側(cè)彎、髖關節(jié)發(fā)育不良和進行性骨骼攣縮。這些患者還存在肺部內(nèi)感受缺陷導致圍產(chǎn)期呼吸窘迫和膀胱導致排尿障礙 [45]。PIEZO1的突變則會損害紅細胞的生理功能和淋巴系統(tǒng)的發(fā)育 [46-50]。
圖10 溫度和觸覺受體（褚劉薇）
如Julius在諾獎公布后的采訪中所說：“感覺系統(tǒng)是偉大的，正是有了它，我們才能感知到我們所生活的世界的一切?！睖囟群陀|覺受體的發(fā)現(xiàn)，是繼視覺、嗅覺、味覺、聽覺之后人類與客觀世界又一次激動人心的握手。我們的身體正通過小小的受體蛋白努力感知著我們所生活的世界的一切，我們怎么能視周遭的一切為理所當然，讓點滴微妙但珍貴的生命體驗白白流逝呢？
- 致 謝 -
感謝浙江大學王立銘、清華大學肖百龍、加州大學舊金山分校張凱華、以及上?？萍即髮W王絳、高瑄、吳松輝和李秋凝等在寫作過程中提供的指導和幫助。感謝上?？萍即髮W綜合辦公室、科技處與生命科學與技術(shù)學院的支持。
參考視頻：
https://www.youtube.com/watch?v=imk3AuS-kUA
https://www.youtube.com/watch?v=x_SRDtwUx6Y
制版編輯 | 盧卡斯
