驗孕棒背后的科技力量：他把驗孕時間從近2小時縮減至5分鐘
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快速驗孕技術(shù)的發(fā)明者古那司·沃克斯（圖中），右側(cè)為他的妻子，左側(cè)為他的合作伙伴，圖片來自makanaalohafoundation.org
在當代生物醫(yī)學(xué)史上，有很多輝煌的瞬間。為解決一個科學(xué)或技術(shù)上的問題，科學(xué)家和研發(fā)人員們冥思苦想，試盡各種手段而不得入其門。然而在某一瞬間，一個全新的思路、一個突如其來的想法在他們的腦海中閃現(xiàn)。這些想法被驗證后讓問題迎刃而解。還有的時候，一個實驗在屢次失敗、幾乎絕望的情況下會突然獲得意想不到的成功。
這些瞬間改變了個人的命運、公司的前途、和科學(xué)技術(shù)的歷史進程。它們可能是所有科研人員夢寐以求、苦苦追尋的那種時刻。它們是日積月累百轉(zhuǎn)千回后的剎那爆發(fā)，是山窮水盡柳暗花明時的豁然開朗。本系列將捕捉、記錄幾個這樣的瞬間。
這篇講述的是雜交科技（Hybritech）公司和ICON技術(shù)的故事?，F(xiàn)在市場上的驗孕棒和很多快速診斷手段都是建立在ICON技術(shù)基礎(chǔ)之上。
撰文 | 金淘沙揀
1978年，Ivor Royston 和 Howard Birndorf 在美麗的南加州圣地亞哥聯(lián)合創(chuàng)立了 Hybritech，旨在開發(fā)新興的單克隆抗體技術(shù)。公司名字是由 “hybridoma”（雜交瘤）和 “technology”（技術(shù)）兩個詞合成的。著名的VC公司凱鵬華盈（KPCB）是它的主要投資人。在 KPCB 的合伙人 Brook Byers 的推動下，Hybritech主攻診斷行業(yè)。在1981-1986期間，他們推出了一系列以單抗為基礎(chǔ)的診斷試劑盒，包括IgE（診斷過敏）、HCG（測懷孕）和PSA（篩查前列腺癌）等診斷產(chǎn)品。
在 Hybritech 之前，診斷試劑盒都是以多克隆抗體為基礎(chǔ)，存在很多缺陷。首先，多克隆抗體每次生產(chǎn)都需要接種動物，流程復(fù)雜，成本高，而且無法保證批次與批次之間的穩(wěn)定性。第二，多克隆抗體的特異性差，和靶抗原之外的其它抗原也會結(jié)合，測試容易出現(xiàn)假陽性。第三，多抗對靶抗原的親和性不高，導(dǎo)致測試的靈敏度低。第四，以多抗為基礎(chǔ)的診斷手段幾乎全都用到放射性同位素，而且流程繁瑣，需要使用離心機，還要多點校正。第五，多克隆抗體無法確定其在靶抗原上的結(jié)合表位，這讓很多后來流行的“三明治“式免疫檢測手段無法實現(xiàn)。而用單克隆抗體取代多抗，這些缺點就都可以避免。
Hybritech最初的幾個產(chǎn)品都是建立在自主開發(fā)的TANDEM技術(shù)之上。TANDEM是今天 “三明治” 式免疫檢測技術(shù)的雛形。讓我們以 TANDEM-HCG 檢測方法為例來了解一下這一技術(shù)（圖1）。HCG或人絨毛膜促性腺激素是胚胎周圍細胞（著床后形成胎盤）分泌的一種蛋白激素，它在孕婦血液和尿液中的濃度會大幅上升。檢測女性尿液中的HCG濃度就成為懷孕檢驗的標準手段。TANDEM-HCG試劑盒中包括兩個靶向HCG的小鼠單抗，一個靶向HCG的α亞基（“一抗”），固定在塑料珠子的表面；另一個靶向HCG的β亞基（“二抗”），游離在溶液中。二抗或者用同位素標記，或者和酶偶聯(lián)。偶聯(lián)的酶會把無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩漠a(chǎn)物。一抗的作用是捕捉、固定抗原，而二抗的作用是產(chǎn)生信號，便于定性或定量測定。
圖1. TANDEM-HCG測試的工作機理。注：圖中HCG形象來自參考資料4
Hybritech的主要客戶是臨床實驗室，主要競爭對手為雅培、羅氏等大公司。Hybritech是第一家將單抗技術(shù)引進診斷產(chǎn)品的公司，在創(chuàng)立早期占有技術(shù)優(yōu)勢。但由于單抗雜交瘤技術(shù)的兩位發(fā)明人并沒有申請專利，其它競爭對手也有可能快速跟進，所以Hybritech在成立初期小心翼翼，盡量避免和大公司正面交鋒。比如，他們特意避免去開發(fā)乙肝病毒測試盒，那是雅培的一個主要診斷產(chǎn)品。雖然他們預(yù)測使用單抗會顯著提高這一產(chǎn)品的靈敏性和特異性，但他們并不想過早地引起雅培的注意。
然而，競爭的到來是必然的，只是早晚的事。當Hybritech推出TANDEM-HCG產(chǎn)品時，由于其測試時間只要1小時45分鐘，而且性能優(yōu)于市場上其它競爭產(chǎn)品，它迅速地成為市場領(lǐng)頭產(chǎn)品。不久羅氏也推出了類似的HCG診斷產(chǎn)品，將測試時間縮減到1小時30分鐘。TANDEM-HCG 的銷售增長因此出現(xiàn)停滯。Hybritech面臨的挑戰(zhàn)一是要不斷推出更好的新產(chǎn)品，二是要不斷改善舊產(chǎn)品，保持甚至擴增已有的市場份額。我們故事的主角就是在這個時刻低調(diào)出場的。
古那司.沃克斯（Gunars Valkirs）是土生土長的圣地亞哥人。他對數(shù)學(xué)有極高的天分，但又不想做純粹的數(shù)學(xué)研究。于是在讀本科時他選擇了加州大學(xué)圣地亞哥UCSD的物理專業(yè)。1974年，大學(xué)畢業(yè)前夕，沃克斯在申請研究生院時收到了哈佛的錄取通知書。他的本科指導(dǎo)教授則勸他留在UCSD，在他的實驗室完成博士學(xué)位，并答應(yīng)給他助研獎學(xué)金，這樣他在研究生期間只需專心科研，而不需要教課。沃克斯同意了。其實使他留在圣地亞哥的最重要的因素是天氣—— 他擔心自己忍受不了波士頓漫長而又寒冷的冬天。
圖2. 1997年的古那司.沃克斯 (Gunars Valkirs)。圖片來源：參考資料8
沃克斯攻讀博士的過程并不順利。他要拿的是物理學(xué)博士學(xué)位，但論文課題是用免疫手段研究光合細菌的膜蛋白。也就是說他的科研是跨界的——他學(xué)的是物理課，研究生資格考試考的也都是物理科目，而做的實驗卻是生物方面的。這種錯位讓他在遇到困難的時候很難找到合適的人指導(dǎo)。好在他的導(dǎo)師對他比較寬容，并不催促他畢業(yè)。這樣，他花了8年的時間才獲得了博士學(xué)位。
在讀博期間，沃克斯就一直關(guān)注當?shù)氐腍ybritech公司——陽光下山頂上那群閃閃發(fā)光的建筑格外惹眼。他也了解Hybritech的技術(shù)和產(chǎn)品，感覺和自己的研究方向很契合。1981年12月的一天，他徑直來到了Hybritech，和前臺說自己要申請工作。他填寫了幾份表格便離開了。Hybritech是他當時申請的唯一一 家公司，這也是他人生中唯一的一次求職經(jīng)歷。
沃克斯遇上了一個很好的時機。Hybritech剛于1981年10月完成IPO，銀行賬戶里存著剛募集來的一千兩百萬美金。Hybritech雄心勃勃，準備招兵買馬，擴大規(guī)模。在經(jīng)過一天的面試后，沃克斯于1982年2月收到了Hybritech的聘函。他的聘用后來讓 CFO Tim Wollaeger 迷惑不解，“我們招一個物理博士干什么？”
沃克斯的主要工作是改善TANDEM診斷技術(shù)，提高它的速度和靈敏性。他很喜歡Hybritech的工作環(huán)境。實驗室里的儀器都是新的，這和學(xué)校不一樣。他和同事們也相處融洽，雖然怪人不少，但好在大家之間平等、自由。
在沃克斯到來之后，Hybritech推出了TANDEM顯色技術(shù)。一抗被固定在直徑為0.6厘米的尼龍珠子表面，測試時需要取一個珠子放在試管里，再添加待測樣品液和酶聯(lián)二抗。二抗上偶聯(lián)的是堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）。三樣?xùn)|西混合好之后，需要不斷搖晃30分鐘，以便形成 “尼龍珠-一抗-HCG-酶聯(lián)二抗” 的復(fù)合體。之后，還要將尼龍珠反復(fù)清洗，洗掉沒有結(jié)合的二抗。接著在溶液中加入底物磷酸吲哚酚（indoxyl phosphate），最后再等30分鐘。磷酸吲哚酚被堿性磷酸酶轉(zhuǎn)變?yōu)榈逅{（indigo blue）。這個淺藍色的溶液再被放到光譜儀里讀取它在405納米的吸光度。這種改進的技術(shù)將測試的時間縮短到了1小時15分鐘。
即便如此，沃克斯仍然需要繼續(xù)改進TANDEM顯色技術(shù)，但花了很長時間并沒有找到好的方法。在他加入 Hybritech 兩年后，一個突破的契機終于出現(xiàn)了。
1984年1月，在一個實驗室會議上，沃克斯被要求介紹一下免疫測定中的反應(yīng)動力學(xué)。這促使他開始從這個角度思考免疫檢測技術(shù)?？贵w與抗原結(jié)合的速率與抗體的濃度成正比?？贵w的有效濃度越高，待測的抗原與之結(jié)合的速度越快。提高抗體有效濃度的一個方法是增加其附著在固體基質(zhì)上的密度，另一個方法是增加固體基質(zhì)表面積和樣品液體積的比例。比如將一個大珠子換成很多很小的珠子，在抗體表面密度不變的情況下，可以縮短反應(yīng)時間。沿著這一方向思考，也許珠子不是最合適的固體基質(zhì)幾何形狀。圓珠作為固體基質(zhì)還有一個重要缺陷。根據(jù)流體力學(xué)的理論，溶液中的珠子表面會形成一個相對靜止的溶劑包圍層，阻止了抗原接近一抗，也就增加了反應(yīng)時間。沃克斯需要從圓珠里 “跳” 出來。
用什么形狀的固體基質(zhì)可以增加其表面積和樣品液體積的比例呢？沃克斯想，如果說使用珠子是溶液包圍基質(zhì)，那么為什么不用基質(zhì)包圍溶液？把珠子換成一個內(nèi)部充滿微小孔洞的薄膜就可以做到這一點。薄膜內(nèi)的孔洞雖小（微米級，肉眼無法看出），但其尺寸還遠遠大于抗體的維度（納米級）。如果抗體涂滿了每個孔洞的內(nèi)壁，從薄膜中流過的溶液中的抗原則可以四處碰壁，輕易結(jié)合被拴住的抗體。這實際大大增加了一抗的有效局部濃度，也就大幅縮短了抗原-一抗的平均結(jié)合時間。
圖3. 尼龍膜的掃描電鏡照片。圖片來源：http://www.hawach.com/products/nylon-membrane-filters/
沃克斯在紙上寫下了一個反應(yīng)動力學(xué)公式，再進行一番演算推導(dǎo)，然后代入從實驗中得到的和從文獻中查到的數(shù)據(jù)。他的結(jié)論是在半秒的時間內(nèi)，膜內(nèi)溶液中接近70%的HCG已結(jié)合上一抗！（圖4再現(xiàn)了沃克斯的計算過程，用到了一點微積分。有興趣的朋友可以研究一下。）酶聯(lián)二抗與一抗-HCG結(jié)合的動態(tài)過程和速率與第一個結(jié)合過程類似。
圖4. 沃克斯在紙上的計算。他的結(jié)論是如果使用薄膜，膜內(nèi)溶液中大部分抗原在不到1秒的時候已和固定的一抗結(jié)合完畢。
膜內(nèi)溶液體積有限。他需要找到一種方法迫使溶液能單向穿膜而過，不斷有新的樣品液補充進來。一個半徑為1厘米的圓膜能浸滿約40微升的液量，如果每半秒完全換液一次， 那么0.5毫升的樣品液全部浸膜而過需要13次換液，總時間不到7秒鐘。這將是對 TANDEM 技術(shù)的另一項改進—— 用強制單向流過取代被動擴散。
沃克斯興奮不已。這套方法在理論上立得住腳，下面他需要用實驗來證明它的可行性。沃克斯開始因地制宜地組裝第一個簡易裝置。他把一個試管的底部切掉，把幾個香煙的過濾嘴塞進去，再鋪上一個玻璃纖維膜。經(jīng)過處理的玻璃纖維膜載滿了一抗蛋白，而過濾嘴纖維則起到吸液的功能，通過毛細管現(xiàn)象不斷引流膜里的溶液，迫使膜內(nèi)換液。
沃克斯開始了第一個實驗。他在膜上滴了5滴陽性樣品液和3滴酶聯(lián)二抗溶液，過了一分鐘，再用2毫升的洗液連續(xù)洗膜，把沒有結(jié)合的酶聯(lián)二抗洗脫掉。沃克斯屏住呼吸，往膜上滴加了3滴底物溶液。檢驗的時刻到了！不到一分鐘的時間，纖維膜上出現(xiàn)了藍色，而且越來越深。如同慢鏡頭里夜空中的煙花，試管里的靛藍色在他眼前徐徐綻放，令他猝不及防、欣喜若狂。
在新思路指導(dǎo)下的第一個實驗就這樣成功了。沃克斯的任務(wù)是將TANDEM的測試時間砍掉20%，沒想到他竟將其縮短了90%。一個5分鐘的測孕方法誕生了。這一新技術(shù)已超越了TANDEM的模式，后來被命名為ICON（代表 immuno-concentration 或免疫濃縮）。
不久后的一天，Hybritech 的營銷總監(jiān) Cole Owen，在經(jīng)過一個實驗室時，看到沃克斯坐在地上，一手拿著錘子，一手拿著一個長條木塊兒，正嘭嘭地敲打幾塊類似于紗布的東西。他不禁問沃克斯：“你到底在干嘛？” 沃克斯給他講了他的嘗試和已經(jīng)成功的實驗，并告訴他正準備制備更多的膜，再重復(fù)幾次。Owen聽完眼前一亮。他以前在強生公司工作過，非常了解驗孕診斷技術(shù)的發(fā)展歷史。在強生首次推出以（多抗）免疫技術(shù)為基礎(chǔ)的測孕診斷產(chǎn)品之前，測孕必須使用活的青蛙?！爱斘乙庾R到沃克斯在做什么時，我差點兒靈魂出竅！” 他馬上回到辦公室，打了幾個電話，四處尋找替代香煙過濾嘴的更好原材料。
ICON-HCG 項目剛開始并沒有受到公司重視。研發(fā)人員都意識到這一技術(shù)的巨大優(yōu)勢，但公司的資源有限，大部分人力已被其它項目占據(jù)。于是有一天，沃克斯拿著他的簡易裝置，敲開了 CFO Tim Wollaeger 辦公室的門，當場給他演示5分鐘的測孕過程。“太神奇了！簡直是魔術(shù)！” Wollaeger 被徹底征服了。他開始向其他高管極力推薦這一項目。Hybritech總裁David Hale提議由Wollaeger來帶頭成立項目團隊來推動此事，他欣然同意。至此，ICON-HCG項目開始進入產(chǎn)品開發(fā)階段。
沃克斯的簡易裝置離可以銷售的產(chǎn)品還有相當長的距離要走，有大量的工作要做。開發(fā)團隊開始設(shè)計可以批量生產(chǎn)的產(chǎn)品。香煙過濾嘴被換成可大量購買的醋酸纖維素，玻璃纖維膜被換成了尼龍膜，在膜與醋酸纖維素吸床之間又添加一個多孔的塑料支架（圖5）。一抗也不需要附著在一整片膜上，而只是集中在膜正中間一個直徑為半厘米的圓形區(qū)域。如此一來，陽性結(jié)果是由白色膜正中的一個藍點顯示，增加了對比，更容易判斷結(jié)果，也節(jié)省了一抗的用料。
圖5. ICON裝置的剖面圖。右圖是得到陽性結(jié)果時，從上往下看到的效果圖。注: 左圖來自參考資料9
ICON-HCG申報走的是510(k)途徑，需要數(shù)據(jù)證明它和市場上已銷售的某種診斷產(chǎn)品等效。Hybritech獲得了當?shù)氐挠媱澤\所（Planned Parenthood Clinics）提供的600多個尿樣。他們用這些樣品對ICON-HCG和TANDEM-HCG進行比較, 很快完成了臨床試驗，并獲得了FDA批準。1984年9月30日，Hybritech給客戶發(fā)出了第一批ICON-HCG試劑盒。此時距離沃克斯的第一個實驗只有8個月的時間。
在ICON-HCG產(chǎn)品開發(fā)及上市頭一年，它的生產(chǎn)全靠手裝。Hybritech還沒有來得及設(shè)計自動化生產(chǎn)流程。公司全體成員，不論職位，只要有空兒就用食堂托盤盛上原料和部件，加班加點地組裝測孕試劑盒。
在第一次銷售動員會議上，50個銷售代表每人搶到了一個剛組裝完的試劑盒。在會議中間歇息時，他們迫不及待地跑到辦公室給客戶打電話：“我現(xiàn)在還在開會，等會議一結(jié)束就去見你。你不知道我們的新產(chǎn)品有多酷!” Hybritech的銷售經(jīng)理Kim Blickenstaff有一次到德克薩斯州的一個醫(yī)療中心去宣傳快速測孕盒。消息迅速在幾個醫(yī)院內(nèi)部散開。幾名醫(yī)護人員從走廊追到了電梯里，從電梯里出來后迫不及待地要求Blickenstaff立刻演示一下產(chǎn)品的操作。在一大堆人的圍觀下，Blickenstaff就在電梯旁邊的打印機上做了一個測試。他從未見過如此瘋狂的場面。
Hybritech把ICON-HCG定價為每盒三美元，比市場上競爭產(chǎn)品高出一塊錢，目標是搶占市場頂端。ICON-HCG產(chǎn)品一上市，銷售就遠超預(yù)測，僅12月份就賣出一百萬個診斷盒。不到一年的時間，ICON-HCG奪得了40%的市場份額，貢獻了Hybritech全年銷售額的三分之一。頭3年的累積銷售額達到3千萬美元（相當于今天的7.3千萬美元）。
ICON-HCG也開辟了新的市場。除了臨床實驗室，每個急診室也開始裝備這一產(chǎn)品。當面對一個女性患者時，急診醫(yī)生需要確定的第一個問題是她是否已經(jīng)懷孕，然后才能決定是否進行X射線檢測、該服用什么藥。在ICON-HCG推出之前，醫(yī)生沒有快速而有效的方法回答這一問題，只能問患者本人。但很多情況下患者本人也并不清楚。ICON-HCG測試既快速又準確，讓急診醫(yī)生不再因此而傷腦筋。
由于不需要使用任何儀器，ICON-HCG 又進一步擴展到了醫(yī)生辦公室。之前的流程是，女士想要知道自己是否懷孕，需要約見醫(yī)生，然后帶走一個杯子。第二天早晨她先在家采集尿樣，再送回到醫(yī)生辦公室。護士再把尿樣送到臨床實驗室，大約需要一天的時間才收到結(jié)果。醫(yī)生最后將結(jié)果告訴那位女士。而如今醫(yī)生辦公室已配備了ICON-HCG，快速而靈敏，不需要使用晨起后的初尿，結(jié)果立等可取，再也不需要三天的等待時間。
幾年以后，在Hybritech被禮來收購后，其它的公司推出了家用測孕棒，將市場進一步擴展。家用測孕棒沿用的還是 ICON-HCG 的基本機理，但引進了橫向流動（區(qū)別于ICON的縱向流動）和膠體金顆粒。今天全世界每年賣出17億個驗孕棒。它們都源自1984年1月的那個實驗。
ICON的成功讓沃克斯成為公司的英雄。他獲得了更大的自由去鉆研其它項目，并可以招人幫助自己。1986年，禮來以4.5億美元的價格收購了 Hybritech。一年多以后，由于文化和理念的沖突， Hybritech 的骨干陸續(xù)離開了禮來，其中包括沃克斯。
沃克斯和三名 Hybritech 的前同事于1988年聯(lián)合創(chuàng)立了Biosite公司，把ICON技術(shù)和單抗技術(shù)應(yīng)用到小分子檢測上。經(jīng)過最初幾年的挫折，Biosite 陸續(xù)推出毒品檢測、心臟病檢測等產(chǎn)品。在2000年 – 2005年期間，公司的年銷售額已超過2億美元，并以每年平均46%的速度增長。2007年，診斷公司 Inverness （2010年改名為Alere，2017年被雅培收購）以16.8億美元的價格收購了Biosite.
退休后的沃克斯移居到了夏威夷的茂宜島。他租用了一個占地50英畝的農(nóng)場，和當?shù)氐拇髮W(xué)合作，嘗試能否在夏威夷大規(guī)模種植可可樹。實驗成功了，但等到約7千棵可可樹第一次豐收的時候，沃克斯卻為如何處理這么多的可可豆犯了愁。從夏威夷往外運送可可豆的成本太高。沃克斯干脆成立了一家公司，在離農(nóng)場2英里的地方建了一個巧克力工廠，加工這些可可豆。他和家人也不缺錢花，就宣布把公司的所有凈利潤全部捐給茂宜島當?shù)氐墓娼M織。消息一傳出，立刻造成轟動，引起媒體爭相報道。
2020年3月15日，在夏威夷茂宜島，沃克斯公司旗下的第一家實體巧克力店開張了。該店出售世界一級的黑巧克力和牛奶巧克力，每類巧克力又有四種風味：薄荷、血橙、檸檬草和茂宜咖啡。但不到一周，由于新冠病毒疫情的爆發(fā)，巧克力店暫時關(guān)閉。好在人們隨時可以在網(wǎng)上購買該店的巧克力。
圖6. 沃克斯在自己的巧克力工廠里工作。右圖為他們生產(chǎn)的巧克力，每片重5克。圖片來源：參考資料12
2020年7月份，當我在電話里采訪沃克斯時，我問他是否還記得36年前的一些細節(jié)。他笑了。每個公式、每個實驗他都銘記在心。尤其是第一次在他眼前盛開的那一抹靛藍。
致 謝
感謝 Gunars Valkirs 博士在百忙之中通過電話接受我的采訪，并通過email回答我的后續(xù)問題。他的人生中有很多精彩瞬間。感謝他和我分享其中之一。
制版編輯 | 常春藤
