真相還是假象？神經(jīng)所楊輝CELL論文再遭質(zhì)疑
2020年4月，中國科學院神經(jīng)科學研究所研究員楊輝課題組在Cell 上發(fā)表研究論文。2020年7月，美國加州大學付向東教授舉報楊輝“ “剽竊和涉嫌造假等學術(shù)道德不端行為”。造成中國國內(nèi)學術(shù)界軒然大波。一波未平，一波又起，2021年2月1日，美國哈佛大學、霍普金斯大學等校教授（包括美國科學院院士）公開發(fā)表文章，提出多種質(zhì)疑。海內(nèi)外神經(jīng)科學家在本文發(fā)表公開意見。
獨家探爭議｜上海學術(shù)新星遭舉報，審稿人現(xiàn)身稱曾拒稿
楊輝再發(fā)聲明：沒有及時交流工作進展，深表歉意
付向東首次回應：與神經(jīng)所楊輝論文爭議始末
2020年7月，一封舉報信在網(wǎng)上流出。加州大學圣地亞哥分校細胞和分子醫(yī)學系教授付向東實名向中科院、科技部、基金委舉報中科院神經(jīng)所研究員楊輝，稱其有 “剽竊和涉嫌造假等學術(shù)道德不端行為”。被質(zhì)疑的楊輝的論文于2020年4月30日發(fā)表在Cell 上。
此后，付向東向《知識分子》確認，在與神經(jīng)所溝通，希望提供DNA引物訂單證據(jù)無果后，確實投遞了這封舉報信。盡管楊輝也通過其他媒介作出了回應，但付向東卻認為 “明顯避重就輕、文過飾非”。言外之意，沒有正面回應他的質(zhì)疑。
數(shù)月過后，當兩人的爭議漸趨平靜時，神經(jīng)再生領(lǐng)域的多位專家卻依然發(fā)表文章，懷疑楊輝的那篇Cell 論文中看到的可能是假象，部分結(jié)論需要獨立的重復檢驗。
那么，疑點在哪呢？
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在最常見的三種視網(wǎng)膜疾病中，老年黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變會導致作為光感受器的視桿和視錐細胞喪失；青光眼會導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞丟失。這三種視網(wǎng)膜神經(jīng)元的丟失造成了大部分不可逆轉(zhuǎn)的眼盲。單在美國，這三種疾病共折磨了近1500萬人，并且隨著人口老齡化，其患病率也在增加。
那么，如果有療法可以讓這些丟失的視網(wǎng)膜神經(jīng)元再生，就有很重要的臨床意義。
2020年4月，澳門科技大學教授張康和付向東等合作發(fā)表文章，在敲低視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞穆勒（Müller）細胞的某種蛋白質(zhì)PTBP1的表達后，發(fā)現(xiàn)穆勒細胞轉(zhuǎn)變成了視錐細胞，且視錐參與的光反應顯著恢復。
緊接著4月30日發(fā)表的楊輝Cell 論文，用了不同的技術(shù)手段，同樣敲低了穆勒細胞中同一個PTBP1的表達，卻將穆勒細胞轉(zhuǎn)化為了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。
2021年2月1日出版的The Journal of Clinical Investigation 上，發(fā)表了約翰霍普金斯大學教授 Seth Blackshaw 和哈佛大學教授 Josh Sanes 的觀點文章（以下簡稱JCI文），二人在考察了最近出現(xiàn)的一些看起來很 “給力” 的研究后，發(fā)現(xiàn)不少矛盾之處，其中就涉及到上述兩篇研究，作者指出——
都是一樣敲低了視網(wǎng)膜穆勒細胞中PTBP1的表達，穆勒細胞卻轉(zhuǎn)化成了不同類型的神經(jīng)元——一個是視錐細胞，一個是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，這種不同需要解釋。
Blackshaw和Sanes都是研究視覺系統(tǒng)發(fā)育、損傷和再生的資深專家，后者是美國科學院院士。
事實上，除了JCI文指出的這點不同，付向東于2020年6月24日發(fā)表的Nature 論文的部分結(jié)論和楊輝這篇Cell 論文更有著直接的矛盾。
比如，付向東是通過RNA干擾技術(shù)降低PTBP1基因表達，在帕金森小鼠中腦的黑質(zhì)致密部，把星型膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成了多巴胺能神經(jīng)元，并進一步投射到紋狀體。
而楊輝則是通過基因編輯技術(shù)，敲低PTBP1基因表達，直接在帕金森小鼠腦中的紋狀體區(qū)域，把星型膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成了多巴胺能神經(jīng)元。
然而，除了在中腦外，付向東還在其它腦區(qū)多做了些驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠紋狀體星形膠質(zhì)細胞中敲降PTBP1并不能夠再生出多巴胺能神經(jīng)元。
這與楊輝的結(jié)論直接沖突。
“紋狀體里95%都是GABAergic神經(jīng)元，所有有轉(zhuǎn)分化的文章得到的都是這類的神經(jīng)元，只有加了多巴胺能神經(jīng)元特有的因子才能得到一定量的多巴胺能神經(jīng)元。有經(jīng)驗的人一眼就能看出楊輝的細胞都是些死細胞。大家都知道抗體很容易附著在死細胞上，因而得出不合常理的結(jié)論。” 付向東向《知識分子》表示。
楊輝的結(jié)果也讓另外一些神經(jīng)科學家感到驚訝。
“紋狀體內(nèi)的神經(jīng)元主要都是GABAergic的（神經(jīng)元），在這樣的微環(huán)境下，紋狀體的膠質(zhì)細胞理論上變成GABAergic神經(jīng)元的可能性會比較大。如果要變成多巴胺神經(jīng)元，我想應該需要一些特定的因子來推動?！?暨南大學粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院教授陳功告訴《知識分子》。
他還進一步表示， 如果在紋狀體里再生了多巴胺神經(jīng)元，應該深入了解這些本來不存在的、突然出現(xiàn)的多巴胺神經(jīng)元，是否可能會對紋狀體的局部神經(jīng)環(huán)路、乃至更廣泛的大腦神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)生不良影響。
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除了這些直接的矛盾，楊輝的論文還有其他令人驚訝的地方。
在他的論文中，不僅穆勒細胞轉(zhuǎn)化為了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，且新生的細胞軸突也能夠迅速通過視神經(jīng)投射到外側(cè)膝狀體核（LGN）和上丘（SC）并修復了模型動物損傷的視覺功能。
JCI文的作者提醒到，成年哺乳動物視網(wǎng)膜當中的軸突化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的再生效率是比較低的，且再生軸突的數(shù)量也是很有限的，也很少會達到中央目標（central targets）。
“軸突生長和其它中間狀態(tài)相比，時間更長，應該比較容易觀察并記錄下來。對長距離軸突投射神經(jīng)元來說，產(chǎn)生新的神經(jīng)元只是功能恢復的第一步，后期軸突生長，導向，突觸形成，和髓鞘形成每一步都必不可少。” 約翰霍普金斯大學醫(yī)學院教授周峰泉告訴《知識分子》，在軸突再生領(lǐng)域，如何在成年動物神經(jīng)系統(tǒng)中（缺少許多發(fā)育過程中的導向因子和支持的外部環(huán)境）正確導向再生的軸突回到原來的靶點仍然是一個難題。
而在2020年12月發(fā)表在 The FEBS Journal 的綜述文章中，周峰泉認為，楊輝論文中新產(chǎn)生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的軸突生長太快了，數(shù)量也太多了，他在論文中具體闡述道——
“在兩周內(nèi)，楊輝研究新產(chǎn)生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的軸突就從外核層（ONL）一直長到中腦的上丘，每周生長7.5毫米，而大多數(shù)的軸突再生研究，四周后才達到視交叉，每周只長1毫米，且到了視交叉的大多數(shù)再生軸突都找不到目標腦核的路途；此外，在另外一項遵循細胞移植策略的研究中，在所有移植的具有高度再生能力的P0小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中，只有極少數(shù)能實現(xiàn)軸突再生，那些確實能延伸出軸突的，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層移植3周后，只有非常有限的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞把軸突延伸至了視網(wǎng)膜視神經(jīng)的出口，離視交叉和上丘還差很遠。”
付向東則認為，楊輝的工作認為視神經(jīng)可以以正常發(fā)育十倍的速度生長，“完全違背科學常識?！?/span>
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這些相互矛盾、甚至有反常識的現(xiàn)象如何解釋？膠質(zhì)細胞到底是不是真的轉(zhuǎn)化成了神經(jīng)元？
在考察了當前涌現(xiàn)的諸多神經(jīng)原位再生的研究后，JCI文的兩位作者、周峰泉等業(yè)內(nèi)不少專家都意識到，要排除假象，需要做更多的檢驗以完善證據(jù)鏈條。
首要面對的是 “泄漏” 的問題。
我們的大腦，比如視網(wǎng)膜，主要有兩類細胞，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。這些實驗總的目標是把部分膠質(zhì)細胞變成神經(jīng)元，流行的方法是用病毒把某種工具包（包括啟動子）專一性的遞送到膠質(zhì)細胞里進行干預（比如過表達或者敲除某個基因），為了跟蹤這些膠質(zhì)細胞，工具包里也會帶熒光蛋白基因。這樣，原則上就可以看哪些膠質(zhì)細胞真的變成了神經(jīng)元。
但理想和現(xiàn)實存在差距，實際中，某些工具包的設(shè)計并不能保證僅僅對膠質(zhì)細胞進行操作或標記。
”這個意思就是，你以為你設(shè)計的反應是應該百分百在膠質(zhì)細胞里面進行的，但實際上不完全是，而且當你用的病毒滴度越高，這種反應越可能會在神經(jīng)元里面進行，所以如果你使用了過量的病毒，就有可能直接在神經(jīng)元里面看到原本應該在膠質(zhì)細胞里表達的熒光蛋白，這樣你以為看到了轉(zhuǎn)變后的新神經(jīng)元，但也許只是原來的神經(jīng)元?！?陳功解釋說。
就泄漏而言，周峰泉認為，楊輝等人實驗中用的AAV病毒、GFAP啟動子，特異性都成問題。
“首先使用的AAV病毒本身就會感染視網(wǎng)膜內(nèi)的不同種類細胞，包括神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）和膠質(zhì)細胞（如穆勒細胞）。同時，特異性針對穆勒膠質(zhì)細胞進行基因編輯主要是通過使用GFAP膠質(zhì)細胞特異性啟動子，但GFAP啟動子膠質(zhì)細胞特異性并不是100%可靠。含GFAP啟動子的基因也可能在神經(jīng)元細胞里表達?！?他說。
不過，陳功也提醒，泄漏的存在并不應該把膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的可能性徹底否定掉。
在具體實踐中，他的團隊和國際上許多其他團隊曾使用逆轉(zhuǎn)錄病毒來證明膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)分化，原因是逆轉(zhuǎn)錄病毒只會針對分裂型的膠質(zhì)細胞，不會泄漏到不分裂的神經(jīng)元里。他的團隊還運用膠質(zhì)細胞譜系示蹤小鼠證明了事先標記示蹤的膠質(zhì)細胞確實可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。
“所以，一定要全面客觀地評價原位神經(jīng)再生這一新技術(shù)，不能因為有人做錯了實驗就把整個領(lǐng)域一棍子打死。” 他說。
作為該領(lǐng)域的先行者，陳功也曾發(fā)表文章對一些評論進行了澄清。在他看來，AAV 雖然有泄漏現(xiàn)象，但是只要把滴度降的比較低，是可以把泄漏比例降的很低——
“我們通常推薦用1x108-10GC/ml的滴度把假陽性的比例降到5%或者更低。有些實驗室使用了過高量的AAV，比如超過1x1013GC/ml的滴度，這種高滴度所造成的假陽性值得關(guān)切。有些實驗結(jié)果需要第三方驗證。”
然而，奇怪的是，盡管楊輝的Cell論文使用的不同AAV都是1013的 “高” 滴度，竟然沒有觀察到任何的泄漏。
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另外一個說明確實發(fā)生了轉(zhuǎn)化的方法是證明中間態(tài)的存在。
試想一下，膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)細胞不可能是瞬間發(fā)生的，一定經(jīng)歷了某種中間過程和狀態(tài)——細胞的形態(tài)可能發(fā)生變化，細胞的位置正逐步遷移，細胞內(nèi)部分子和功能也逐步變化。
而在之前的舉報信中，付向東曾指出楊輝Cell 論文缺乏轉(zhuǎn)變的中間狀態(tài)——
“楊輝的這篇《細胞》論文在4月份在線發(fā)表后，許多神經(jīng)生物學領(lǐng)域的專家隨即對其數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性提出了一系列質(zhì)疑，指出論文并沒有確鑿的證據(jù)證明誘導新產(chǎn)生的神經(jīng)元細胞所必經(jīng)的細胞遷移、漸近的細胞形態(tài)和基因表達轉(zhuǎn)變以及新獲得的神經(jīng)電生理特性等等。通俗地說，由于沒有細胞轉(zhuǎn)分化過程的系列實驗數(shù)據(jù)的支持，很難說他們的結(jié)論真實可靠，不能排除他們看到的陽性結(jié)果是出于實驗室常見的實驗假象?！?/span>
付向東認為，支持楊輝結(jié)論的大多數(shù)證據(jù)， 很有可能是由于GFAP-CRE在內(nèi)源神經(jīng)元中的泄漏表達所致。
那么，如何做才能讓人信服？
“就好像一個人坐電梯從10樓下到1樓，總要一層層下，不會一下子就跳到一樓了。我們團隊在小鼠和獼猴的大腦皮層里，都觀察到了星型膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的中間態(tài)，也就是轉(zhuǎn)化早期的細胞既有部分膠質(zhì)細胞的屬性又有神經(jīng)元的部分屬性，這種中間態(tài)的存在是細胞之間轉(zhuǎn)分化的強有力的證據(jù)，” 陳功解釋說。
周峰泉也建議，應盡可能密集地捕捉轉(zhuǎn)變的中間狀態(tài)——
比如，視網(wǎng)膜中穆勒膠質(zhì)細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分布在不同的層，轉(zhuǎn)變意味著，穆勒膠質(zhì)細胞要一步步 “爬” 到目的地，且細胞形態(tài)和轉(zhuǎn)錄組要經(jīng)歷逐步的變化（單細胞測序可以用于做這樣的分析）；最終，新轉(zhuǎn)變成的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，需要進一步追蹤其軸突生長，準確的投射到相應的腦區(qū)并發(fā)揮正常功能（當前腦組織清洗和深度3D影像技術(shù)都可以做這樣的觀察）。
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質(zhì)疑和批評是科學的常態(tài)，也是進步的源泉，尤其是在面對紛繁復雜的新興領(lǐng)域的時候。很多時候，區(qū)分事實和假象并不容易，但“如實報告”是應有的基本規(guī)范和底線。
盡管有各種可供批評之處，不少研究都聲稱緩解或者治療了動物模型的某種神經(jīng)疾病。顯然，基礎(chǔ)研究的結(jié)果越可靠，就越有利于后期的臨床轉(zhuǎn)化。楊輝等人報道的 “誘人” 結(jié)果，無論是治療神經(jīng)性眼盲還是帕金森，引發(fā)更大范圍的關(guān)注自然也不奇怪，如果是一項不重要的結(jié)果，也很少會有人爭搶。
同樣也面臨JCI一文質(zhì)疑的張康向《知識分子》表示，“選擇四月齡甚至更大的rd10小鼠，已經(jīng)檢測不到感光細胞和視網(wǎng)膜電圖信號，再結(jié)合GFAP-CRE追蹤系統(tǒng)，我們認為后形成的感光細胞和功能由穆勒膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化而來”。
他也同時承認，后期需要完善體內(nèi)追蹤系統(tǒng)，包括使用更長或全長GFAP啟動子、double cre，設(shè)置嚴格的對照組，足夠密集的取樣時間點和全面的分析手段，逐級追蹤穆勒膠質(zhì)細胞向神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)化過程，對形成的細胞進行全面的分析，以證明所看到的神經(jīng)細胞真的由穆勒膠質(zhì)細胞而來。
付向東就此也向《知識分子》表示，對于JCI文質(zhì)疑，他們正設(shè)計實驗全面解決AAV泄漏的問題。
截止發(fā)稿時，楊輝沒有回應《知識分子》的電郵詢問。
“我相信如此拉風的研究一定會有人重復，只有重復才能做出最終的判斷?！?陳功說。
