研究發(fā)現(xiàn)修復(fù)基因印記異常大幅提高動(dòng)物克隆效率
修復(fù)H3K27me3印記異常能提高克隆效率、改善克隆小鼠和克隆胎盤的發(fā)育表型
● ● ●
體細(xì)胞核移植（SCNT）是指通過(guò)顯微操作，將單個(gè)體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中的技術(shù)過(guò)程。卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)能將體細(xì)胞核轉(zhuǎn)變?yōu)椤叭軤顟B(tài)”，并發(fā)育成為完整的動(dòng)物。希臘文“Klone”指的是通過(guò)扦插枝條來(lái)對(duì)植物無(wú)性繁殖的方法。由于與扦插繁殖有類似性，體細(xì)胞核移植也被稱為動(dòng)物克隆（Cloning）。
扦插到土壤中的枝條能否生根，是它是否能夠成長(zhǎng)為扦插植物的關(guān)鍵步驟。對(duì)于克隆胚胎來(lái)說(shuō)，“生根”意味著在代孕母體的子宮內(nèi)著床，進(jìn)而形成有功能的胎盤。2006年，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪課題組合作發(fā)現(xiàn)，盡管小鼠克隆胚胎的著床前發(fā)育率可達(dá)相當(dāng)水平，但其移植后的“生根”過(guò)程，即著床后的發(fā)育存在顯著的異常，而這些異常主要體現(xiàn)在胚外組織的發(fā)育異常。受限于研究手段，當(dāng)時(shí)難以對(duì)克隆胎盤缺陷的本質(zhì)做進(jìn)一步闡釋。
2017年，利用人工構(gòu)建的孤雌和孤雄胚胎和早期胚胎測(cè)序技術(shù)，哈佛大學(xué)張毅實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了H3K27me3控制的印記（親本特異性單等位表達(dá)）蛋白編碼基因，其中四個(gè)（Sfmbt2，Gab1，Smoc1，Jade1）在胎盤中受H3K27me3印記，在胎兒中不印記（雙等位表達(dá)）。核移植重編程無(wú)法修正印記的缺陷。例如，對(duì)原始生殖細(xì)胞（不具備完整印記）進(jìn)行克隆，無(wú)法獲得具備完整印記的胚胎，也無(wú)法得到動(dòng)物。一般認(rèn)為，只有“印記正?！钡墓w細(xì)胞才能夠被成功克隆。與很多情況下一樣，對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的更新挑戰(zhàn)了“一般認(rèn)知”：既然體細(xì)胞沒(méi)有H3K27me3印記，也許所有的克隆胎盤都是“印記異?！钡?？這些異常對(duì)克隆胎盤的缺陷有什么貢獻(xiàn)？
最近，中科院動(dòng)物研究所、干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究院與中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等機(jī)構(gòu)的研究團(tuán)隊(duì)合作，鑒定了克隆胚胎的H3K27me3印記基因表達(dá)情況。和預(yù)期一致，這些基因在克隆胎盤中存在過(guò)度表達(dá)。要進(jìn)一步證實(shí)這種過(guò)度表達(dá)對(duì)克隆缺陷的作用，則需要在供體細(xì)胞中單等位敲除四個(gè)H3K27me3印記基因。利用傳統(tǒng)手段無(wú)法在細(xì)胞中一次性實(shí)現(xiàn)四個(gè)基因的單等位敲除，因此研究人員利用小鼠單倍體干細(xì)胞作為敲除載體，利用基因編輯技術(shù)成功獲得了攜帶四個(gè)H3K27me3印記基因單等位敲除的體細(xì)胞——胚胎成纖維細(xì)胞。結(jié)果顯示，這四個(gè)基因的敲除極大提高了體細(xì)胞克隆的效率，從0%（移植404枚野生型克隆胚胎出生0只）提高到最高14.2%（移植49枚四敲除克隆胚胎出生7只，實(shí)驗(yàn)共獲得攜帶H3K27me3印記基因敲除的克隆小鼠39只）。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶這四個(gè)基因的敲除的實(shí)驗(yàn)組克隆小鼠的體重與受精卵來(lái)源的小鼠一致，而對(duì)照組克隆小鼠的體重顯著高于受精卵來(lái)源的小鼠。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組克隆小鼠的胎盤直徑和重量也顯著低于對(duì)照組克隆小鼠，與受精卵來(lái)源的小鼠一致。切片分析發(fā)現(xiàn)，這四個(gè)H3K27me3印記基因敲除之后，克隆胎盤的滋養(yǎng)層比例顯著提升。滋養(yǎng)層提供胎兒與母體之間的物質(zhì)交換，是胎盤“扎根”在子宮中的重要組成部分，也是胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)。野生型克隆小鼠的胎盤較大，可能在一定程度上保證了低滋養(yǎng)層比例下克隆胎兒的營(yíng)養(yǎng)和氣體交換。以上結(jié)果表明胎盤中H3K27me3印記基因異常（雙等位表達(dá)）是克隆動(dòng)物胎盤異常的重要因素。
攜帶四個(gè)H3K27me3印記基因單等位敲除的克隆小鼠可以正常存活至成年，且這些成體小鼠的體細(xì)胞（尾尖成纖維細(xì)胞）在克隆中也展現(xiàn)出與胚胎成纖維細(xì)胞類似的克隆效率與表型的改善。這說(shuō)明H3K27me3印記基因的單等位敲除對(duì)于克隆的提升不受供體細(xì)胞年齡的限制。通過(guò)將這些成體小鼠與野生型小鼠交配和基因分離，得到了四種攜帶不同單H3K27me3印記基因單等位敲除的小鼠。進(jìn)一步克隆這些體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Sfmbt2在提高克隆效率，增大滋養(yǎng)層比例上具有最大貢獻(xiàn)，而Smoc1或Jade1敲除也在改善著床后發(fā)育上有不同程度的貢獻(xiàn)。
2010年，Ogura實(shí)驗(yàn)室報(bào)道單等位敲除Xist能顯著提高小鼠克隆效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管Xist基因在克隆胎盤中也有過(guò)表達(dá)，但在提高成纖維細(xì)胞的克隆效率上，Xist敲除不如H3K27me3印記基因四敲除（或Sfmbt2單敲除）的效果顯著。研究顯示，小鼠的Xist印記同樣依賴于胎盤特異的H3K27me3修飾，這些結(jié)果說(shuō)明，異常的Xist印記可能也屬于本研究所揭示的H3K27me3印記依賴的體細(xì)胞克隆障礙。本研究結(jié)果顯示，胎盤的H3K27me3印記異?？赡茉隗w細(xì)胞克隆胚胎中廣泛存在，是克隆胎盤過(guò)大這一常見(jiàn)克隆動(dòng)物發(fā)育缺陷的重要貢獻(xiàn)因素；修復(fù)胎盤中H3K27me3印記基因的表達(dá)異常能夠恢復(fù)克隆小鼠的體重，支持了“克隆動(dòng)物的胎兒過(guò)大，起因是克隆動(dòng)物的胎盤過(guò)大”這一經(jīng)典假設(shè)；找到了提高克隆效率貢獻(xiàn)度最大的H3K27me3印記基因Sfmbt2；由于成纖維細(xì)胞是豬、牛、猴等大動(dòng)物克隆中的廣泛使用的供體細(xì)胞，本研究的結(jié)論或具有廣泛應(yīng)用前景。
相關(guān)研究成果發(fā)表于《細(xì)胞-干細(xì)胞》雜志。動(dòng)物所、干細(xì)胞創(chuàng)新院研究員周琪、李偉及遺傳發(fā)育所研究員陸發(fā)隆為文章共同通訊作者。該研究受到科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金委、中科院、博士后基金等的資助。
注：本文轉(zhuǎn)載自動(dòng)物研究所 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。
