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2020年7月29日，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京大學(xué)黃超蘭團(tuán)隊(duì)，中科院上海生化與細(xì)胞所許琛琦團(tuán)隊(duì)、美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分?；荻鞣驁F(tuán)隊(duì)，聯(lián)手在Cell上發(fā)表了題為“Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的論文，該研究通過(guò)開(kāi)發(fā)基于質(zhì)譜的絕對(duì)定量蛋白質(zhì)組新方法，揭示了T細(xì)胞受體-共受體（TCR-CD3）復(fù)合物酪氨酸在不同抗原刺激下的動(dòng)態(tài)磷酸化修飾全貌，解析了不同CD3鏈ITAM結(jié)構(gòu)域磷酸化特征的奧秘，從中發(fā)現(xiàn)了其中一條亞基CD3ε的單磷酸化新功能，有望助力于設(shè)計(jì)全新的CAR-T療法。

TCR-CD3復(fù)合物在T細(xì)胞的發(fā)育、激活及對(duì)病原的免疫反應(yīng)中起著決定性作用。這一重要作用來(lái)自于CD3鏈胞內(nèi)端的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif-ITAM)。而ITAM的多樣性功能主要取決于其結(jié)構(gòu)域的酪氨酸（Tyrosine）磷酸化，比如招募SYK激酶家族蛋白ZAP70進(jìn)而激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)。另外，ITAM的功能也被廣泛應(yīng)用在對(duì)嵌合抗原受體（CAR）的研究中。其中CD3ζ亞鏈便常用于構(gòu)建CAR-T細(xì)胞療法抗腫瘤活性，但其他CD3鏈的功能和對(duì)于CAR的設(shè)計(jì)也還有很多未知。

深入探索 CD3 ITAM的酪氨酸動(dòng)態(tài)磷酸化模式可為全面理解不同CD3鏈的功能提供核心信息。TCR-CD3受體復(fù)合物有10個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)域分布著20個(gè)磷酸化位點(diǎn)----，在時(shí)間分辨率下實(shí)現(xiàn)對(duì)全部磷酸化位點(diǎn)的同時(shí)定量分析在技術(shù)上極具挑戰(zhàn)性。為了直觀比較不同TCR刺激下的磷酸化模式，精確繪制出TCR所有酪氨酸磷酸化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，黃超蘭團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種新穎的絕對(duì)定量方法Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass Spectrometry（TIMLAQ-MS）。區(qū)別于目前報(bào)道的蛋白組絕對(duì)定量手段，不需要加入同位素重標(biāo)的合成肽段，而是巧妙地利用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT），設(shè)計(jì)將6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品和4個(gè)分析樣品混合起來(lái)作為內(nèi)標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)樣品為不同濃度梯度的合成非重標(biāo)磷酸化/非磷酸化CD3肽（A）和從未經(jīng)抗原刺激的T細(xì)胞中通過(guò)IgG抗體免疫沉淀下來(lái)的背景蛋白（B）的混合物；用數(shù)據(jù)依賴(lài)采集（Data-dependent acquisition, DDA）結(jié)合平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Parallel reaction monitoring, PRM）的方式獲得抗原刺激下，TCR-CD3免疫沉淀（IP）復(fù)合物中不同酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化/非磷酸化在不同時(shí)間點(diǎn)的定量結(jié)果。TIMLAQ 成功繞過(guò)了以前的定量方法中通常使用的同位素重標(biāo)記肽，既節(jié)約了成本，又有效降低了方法的復(fù)雜性和數(shù)據(jù)采集誤差，進(jìn)一步提高了定量準(zhǔn)確性，最終可完全實(shí)現(xiàn)在一次測(cè)量中對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)全部ITAM磷酸化修飾的絕對(duì)定量，描繪TCR-CD3復(fù)合物的酪氨酸動(dòng)態(tài)磷酸化修飾全貌。

利用這一方法鑒定到在不同的TCR刺激條件下，CD3各亞基主要表現(xiàn)為雙磷酸化修飾模式，而唯獨(dú)CD3ε則呈現(xiàn)出單磷酸化修飾模式。前研究表明，雙磷酸化的ITAM與激酶家族蛋白ZAP70有很強(qiáng)的結(jié)合而激活下游信號(hào)傳導(dǎo)，而單磷酸化的ITAM則表現(xiàn)出很低的結(jié)合性。本文中這一特殊的新發(fā)現(xiàn)驅(qū)使作者進(jìn)一步深入探索CD3ε在TCR通路中的新潛在功能。結(jié)果顯示，單磷酸化的CD3ε可通過(guò)專(zhuān)門(mén)募集抑制性Csk激酶減弱TCR信號(hào)傳導(dǎo)，說(shuō)明TCR中既有激活基元又有抑制基元，總體呈現(xiàn)為一種自制的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。作者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步深入研究，發(fā)現(xiàn)一旦將CD3ε細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域整合到第二代CAR中，CD3ε的ITAM結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)募集Csk減少CAR-T細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而CD3ε的BRS結(jié)構(gòu)域則可以通過(guò)募集p85促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的持久性?？傮w而言，將CD3ε應(yīng)用于CAR的設(shè)計(jì)可顯著提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。

從一個(gè)重要的基礎(chǔ)生物學(xué)問(wèn)題開(kāi)始，為解決問(wèn)題而開(kāi)發(fā)一個(gè)新穎方法，得到新發(fā)現(xiàn)，再深入探索生物學(xué)功能，最后有望貢獻(xiàn)在治療方法上。黃超蘭教授，許琛琦教授和惠恩夫教授作為本文的共同通訊作者，完美地演繹了不同交叉領(lǐng)域共同合作而產(chǎn)生的精彩結(jié)果。

黃超蘭教授是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部精準(zhǔn)醫(yī)療多組學(xué)研究中心主任，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院長(zhǎng)聘副教授，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心研究員，曼徹斯特大學(xué)榮譽(yù)教授。近年來(lái)，黃超蘭教授帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)積極開(kāi)發(fā)基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)新方法，實(shí)驗(yàn)室擁有國(guó)際領(lǐng)先的儀器、技術(shù)和方法，致力于為生物學(xué)和臨床研究中遇到的難題提供最有質(zhì)量保證的全面蛋白質(zhì)組和質(zhì)譜技術(shù)手段。 僅從2015年至今，黃教授在高影響因子的雜志上就發(fā)表了近50篇文章 （目前已累計(jì)發(fā)表SCI論文80余篇），不但自己開(kāi)發(fā)最前沿的質(zhì)譜技術(shù)（迄今為止，課題組研發(fā)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組技術(shù)，在單一體細(xì)胞中鑒定的蛋白數(shù)量是全球領(lǐng)域最高水平），更發(fā)揮了強(qiáng)大的合作力量，以她高超的質(zhì)譜技術(shù)助力了眾多科學(xué)家的科研發(fā)展。曾協(xié)助美國(guó)普林斯頓大學(xué)教授，美國(guó)科學(xué)院外籍院士顏寧課題組，利用質(zhì)譜技術(shù)有效分析了ACAT1蛋白周?chē)坞x的脂質(zhì)，為ACAT1作用底物的鑒定提供了最為直接有效的證據(jù)，相關(guān)工作發(fā)表在Nature上。最重量級(jí)的是協(xié)助中科院院士，西湖大學(xué)校長(zhǎng)施一公教授利用高分辨交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)剪接體復(fù)合物的成分和相互作用進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，促進(jìn)了剪接體復(fù)合物在冷凍電鏡上的超高分辨率結(jié)構(gòu)鑒定，相關(guān)工作發(fā)表在兩篇Science上。