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基因組編輯技術(shù)主要是利用位點(diǎn)特異人工核酸酶在基因組靶位點(diǎn)處引入DNA雙鏈斷裂（DSB），再經(jīng)細(xì)胞自身的非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因敲除和堿基編輯等基因組遺傳修飾。由于其在突變體創(chuàng)制和作物種質(zhì)創(chuàng)新中表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，因此近幾年來該技術(shù)在禾谷類作物研究中得到了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

近日，美國(guó)密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校植物科學(xué)系和唐納德?丹福斯植物科學(xué)中心Bing Yang（楊兵）教授在期刊aBIOTECH在線發(fā)表綜述文章“Genome editing in grass plants”（點(diǎn)擊題目看原文）。文章概述了基因組編輯技術(shù)在禾本科植物中的發(fā)展和應(yīng)用。同時(shí)，作者總結(jié)展望了該技術(shù)在保障和改良禾谷類糧食作物產(chǎn)量品質(zhì)中的應(yīng)用前景。

在近30年來發(fā)展歷程中，逐步形成了以鋅指核酸酶(ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白核酸酶(TALENs)和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas)等三類人工核酸酶為主的基因組編輯技術(shù)。ZFNs和TALENs在組成上類似，由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域融合形成，且FokⅠ需形成二聚體才能發(fā)揮內(nèi)切酶活性。CRISPR/Cas系統(tǒng)則利用RNA引導(dǎo)序列與靶位點(diǎn)DNA序列以Watson-Crick堿基配對(duì)而定位，且Cas蛋白單體行使核酸酶功能。相對(duì)于Cas蛋白的PAM序列依賴性，ZFNs和TALENs則在靶位點(diǎn)選擇時(shí)具有一定的優(yōu)勢(shì)；但由于CRISPR/Cas系統(tǒng)在載體構(gòu)建和多位點(diǎn)編輯的優(yōu)勢(shì)，使其在禾谷類作物基因組編輯中發(fā)展更快應(yīng)用更廣泛。目前通過選用不同的Cas蛋白(例如Cas9或Cas12a)和Cas蛋白人工進(jìn)化(例如xCas9或Cas9-NG)等方式，可有效地提高編輯特異性和擴(kuò)寬識(shí)別PAM。此外由于Cas12a的溫度敏感性，也可通過改變溫度調(diào)控Cas12a在禾谷類作物中的編輯活性。

CRISPR/Cas系統(tǒng)的衍生技術(shù)也在禾谷類作物中不斷得到發(fā)展與應(yīng)用。這其中最重要的就是單堿基編輯技術(shù)，該技術(shù)主要通過核苷酸脫氨酶與Cas9切口酶(Cas9(D10A))形成的融合蛋白在sgRNA的引導(dǎo)下結(jié)合在基因組靶位點(diǎn)處，將靶堿基脫氨形成新的嘧啶或嘌呤，最終實(shí)現(xiàn)靶堿基的定向替換。目前，基于各種胞嘧啶脫氨酶和大腸桿菌腺嘌呤脫氨酶的各種胞嘧啶堿基編輯技術(shù)和腺嘌呤堿基編輯技術(shù)已成功地應(yīng)用于水稻、小麥和玉米中，實(shí)現(xiàn)了堿基對(duì)G·C與A·T的互換。此外，通過將轉(zhuǎn)錄激活蛋白(VP64和TAD等)或轉(zhuǎn)錄抑制蛋白(SRDX)融合在dCas9上，從而實(shí)現(xiàn)水稻內(nèi)源靶基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制。

此外，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)而來的高通量基因組編輯技術(shù)和低成本突變檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)水稻的全基因組層面的突變體庫創(chuàng)制和突變體庫快速篩選和鑒定，這將對(duì)水稻功能基因組學(xué)研究提供強(qiáng)有力的工具。將Cas蛋白和sgRNA mRNA復(fù)合物直接通過基因槍轟擊等方法導(dǎo)入水稻和小麥細(xì)胞可獲得Transgene-Free的基因編輯材料。這些非轉(zhuǎn)基因方法有助于基因編輯材料避開轉(zhuǎn)基因作物安全監(jiān)管。目前已有玉米和水稻的基因編輯品種獲批免除轉(zhuǎn)基因作物安全監(jiān)管。因此，進(jìn)一步開發(fā)新基因組編輯技術(shù)和擴(kuò)展其應(yīng)用范圍對(duì)促進(jìn)禾谷類作物功能基因組解析以及加快禾谷類作物種質(zhì)創(chuàng)新進(jìn)程具有重要意義。

Cite this article as:

Char, S.N. & Yang, B. aBIOTECH (2019). https://doi.org/10.1007/s42994-019-00005-x

注：本文轉(zhuǎn)載自aBIOTECH。

撰文：周煥斌 博士（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所）