復(fù)旦大學(xué)學(xué)者開發(fā)了新的全基因組甲基化檢測方法
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隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)研究進入了“后基因組時代”，而表觀遺傳學(xué)是“后基因組時代”的前沿方向。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的核心組成部分，對于正常細胞功能維持、胚胎發(fā)育等生命過程至關(guān)重要，DNA甲基化紊亂與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。因此，進行全基因組DNA甲基化的檢測和分析對于探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機制以及開發(fā)新的抗腫瘤策略具有重要意義。
近日，復(fù)旦大學(xué)附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心、生物醫(yī)學(xué)研究院雙聘教授于文強團隊開發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的全基因組 DNA 甲基化檢測技術(shù)——導(dǎo)向定位測序（Guide Positioning Sequencing，GPS）。相比于 WGBS，GPS 具有覆蓋率高（高達96%）、可覆蓋GC-rich區(qū)域和重復(fù)序列區(qū)域。利用 GPS對正常肝細胞和肝癌細胞進行全基因甲基化測序，分析發(fā)現(xiàn)基因體（gene body）和啟動子之間的甲基化差異（methylation of genebody difference to promoter，MeGDP）可有效地預(yù)測基因表達，啟動子和增強子中的“甲基化邊界移動（Methylation Boundary Shift，MBS）”能夠調(diào)控與免疫和腫瘤代謝相關(guān)的基因的表達，異常的 DNA 甲基化參與了組織特異性的增強子轉(zhuǎn)換，進而導(dǎo)致細胞身份的轉(zhuǎn)變和肝癌發(fā)生發(fā)展以及肝癌的特異性肺轉(zhuǎn)移，相關(guān)研究2019年1月22日在線發(fā)表于Genome Research上。
GPS可同時獲得樣本的基因組和表觀基因組信息，一舉兩得。目前全基因組 DNA 甲基化檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”為重亞硫酸鹽測序（Bisulfite-sequencing），結(jié)合二代測序，能夠以單堿基分辨率檢測全基因組范圍的 DNA 甲基化。然而，重亞硫酸鹽測序的生物信息學(xué)分析固有的缺陷造成測序的不準(zhǔn)確性和高昂的測序成本。于文強教授團隊歷時八年，開發(fā)了一套新的全基因組 DNA 甲基化檢測技術(shù)——導(dǎo)向定位測序（Guide Positioning Sequencing，GPS），相比于目前最廣泛使用的 WGBS，GPS 具有以下優(yōu)點：
1. 單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化位點檢測；
2. 能夠區(qū)分DNA模板正負鏈甲基化；
3. 能夠覆蓋基因組幾乎所有重復(fù)片段；
4. 檢測費用大幅下降；
5. GPS可以同時檢測基因組和表觀基因組信息。
應(yīng)用 GPS 檢測正常肝細胞以及兩個肝癌細胞系 97L 和 LM3 中全基因組 DNA 甲基化發(fā)現(xiàn)，在人類正常肝細胞中，GPS 對 CpG 位點覆蓋率達 97%，胞嘧啶的覆蓋率達 96%；在肝癌細胞系 97L 細胞中，GPS的比對率為 80.9%，比 WGBS 的覆蓋率高 15～20%。
MeGDP實現(xiàn)了通過DNA甲基化對基因表達的成功預(yù)測。啟動子區(qū)域的DNA甲基化與基因的表達沉默有關(guān)，但從全基因組水平來看，啟動子區(qū)域的DNA甲基化與基因表達沒有關(guān)系。通過對GPS檢測數(shù)據(jù)的分析，我們發(fā)現(xiàn)基因體和啟動子區(qū)域的 DNA 甲基化差異與基因表達之間存在很強的相關(guān)性，并將基因體和啟動子區(qū)域的 DNA 甲基化差異定義為 MeGDP（methylation of gene body differenceto promoter）。MeGDP 與基因表達之間的相關(guān)系數(shù)Rho 高達 0.67，提示 MeGDP 可以做為基因表達的預(yù)測因子。在肝癌細胞中，MeGDP 降低與免疫系統(tǒng)以及代謝紊亂相關(guān)。這些結(jié)果提示，在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤細胞自身內(nèi)源性的免疫相關(guān)的分子通過 DNA 甲基化沉默可能是腫瘤細胞免疫逃逸的重要原因。
MBS，DNA甲基化調(diào)控基因表達的新模式。我們經(jīng)常會遇到即使啟動子的區(qū)域DNA低甲基化，但基因表達水平還是不同。我們通過分析啟動子區(qū)域的DNA低甲基化區(qū)域的寬度，發(fā)現(xiàn)相比于正常肝細胞而言，腫瘤細胞可能在啟動子區(qū)域有更寬的低甲基化。我們將轉(zhuǎn)錄起始位點附近的 DNA 甲基化邊界變化命名為“甲基化邊界漂移“，即MBS（MethylationBoundary Shift，MBS）”。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MBS向TSS下游的延伸與基因的高表達有關(guān)，而這些高表達的基因與核糖體基因的合成和細胞周期相關(guān)，而這些基因無疑與腫瘤密切相關(guān)。
增強子做為重要的順式調(diào)控原件，同樣受到MBS的調(diào)控。與正常肝細胞相比，研究發(fā)現(xiàn) 97L 細胞通過MBS改變了增強子的狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤細胞中增強子的獲得或丟失，而增強子區(qū)域的異常 DNA 甲基化模式可能調(diào)改變強子特性以及所調(diào)控的基因表達，賦予腫瘤細胞新的特性，繼而與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
“同化共生”，腫瘤轉(zhuǎn)移的新機制。物以類聚，人以群分，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也一樣。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的重要原因之一，而腫瘤特異性的器官轉(zhuǎn)移機制并不清楚。例如肝癌容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，我們通過分析肝癌細胞97L和肝癌特異性轉(zhuǎn)移到肺的LM3細胞的DNA甲基化模式和基因表達情況，發(fā)現(xiàn)肝細胞特異性的基因表達降低，而肺細胞特異性的基因表達上調(diào)提示肝細胞身份丟失和肺細胞身份的獲得是肝癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的重要原因。我們的結(jié)果表明，在97L 和 LM3 肝癌細胞系中，肝特異性高表達的基因的數(shù)目分別降低了 74% 和 80%；而肺特異性CKS2 在 97L 和 LM3 中的表達升高，與此同時，在肝癌細胞中的肝特異性增強子減少和肺特異性的增強子增加與 DNA 甲基化異常模式相關(guān)。我們認為增強子區(qū)域異常的 DNA 甲基化異常模式可以調(diào)控增強子的漂移并影響相關(guān)靶基因的表達。我們認為腫瘤細胞通過改變身份，與特異性轉(zhuǎn)移的器官組織細胞通過表觀遺傳學(xué)的機制，進而“同化共生“，肝癌細胞中表達的肺特異性的基因可以幫助肝癌細胞更好地適應(yīng)肺環(huán)境，提示腫瘤細胞身份的丟失以及其他細胞身份的獲得是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要原因，而同化共生可能是腫瘤發(fā)生特異性器官轉(zhuǎn)移的重要分子機制。
復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院博士李晉、李巖，助理研究員李偉，博士羅懷兵，博士后奚艷萍，博士生董世華，國防科技大學(xué)博士高明為本文共同第一作者，復(fù)旦大學(xué)附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心、生物醫(yī)學(xué)研究院于文強研究員，生物醫(yī)學(xué)研究院吳飛珍助理研究員以及國防科技大學(xué)彭邵亮教授為本文共同通訊作者。本研究得到了科技部、上海市科委基礎(chǔ)研究重大專項、上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”、國家自然科學(xué)基金、國家“863”計劃等經(jīng)費的支持。
注：文章來源“上海市公共衛(wèi)生臨床中心科研部”。
