臨床治療新技術(shù)：光遺傳學(xué)不斷制造驚喜
?光遺傳學(xué)。來源：Mike Cohea, Brown University
編者按：
光遺傳學(xué)從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用不過短短十幾年，在人類探索科學(xué)的漫漫長途中，這只是短暫的一瞬，但其從基礎(chǔ)到臨床的轉(zhuǎn)化過程卻非常迅速。在臨床醫(yī)學(xué)方面，光學(xué)調(diào)控已經(jīng)顯出其獨特的優(yōu)勢：光對自然組織沒有損傷，卻可以根據(jù)遺傳工程的設(shè)計，選擇性地對神經(jīng)細(xì)胞活動進(jìn)行激活或調(diào)控。這為治療多種神經(jīng)、精神疾病帶來曙光。雖然目前光遺傳學(xué)還在早期臨床試驗階段，其潛力卻令很多領(lǐng)域的科學(xué)家興奮不已。
撰文 | 周亮（赫爾辛基大學(xué)博士后）
責(zé)編 | 葉水送
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光遺傳學(xué)（Optogenetics）從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的飛速發(fā)展打破了人們對技術(shù)發(fā)展曲線的常規(guī)觀念。從基礎(chǔ)到臨床，光遺傳學(xué)都顯示出了無窮的活力和潛力，眾多新技術(shù)、新設(shè)備和新想法不斷涌現(xiàn)。
用光來控制神經(jīng)細(xì)胞并不是本世紀(jì)全新的想法。早在1979年，DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一、諾貝爾獎獲得者弗朗西斯·克里克（Francis Crick）在《科學(xué)美國人》的一篇文章里就曾暢想，神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展需要一種新的工具，這種工具可以激活或者關(guān)閉特定的神經(jīng)細(xì)胞，同時不影響其他的神經(jīng)細(xì)胞。在這之后，他甚至還想出了一種特異性的控制方法：讓細(xì)胞具有光敏感性[1]。當(dāng)然，在當(dāng)時的理論和實驗基礎(chǔ)下，科學(xué)家們還不足以實現(xiàn)這樣的構(gòu)想。
實際上利用光控制神經(jīng)系統(tǒng)的想法，很多科學(xué)家一直在做，并開發(fā)出各種實用的工具。其中一種是把對光敏化學(xué)物質(zhì)溶在神經(jīng)組織周圍的體液里，當(dāng)光線照射時化學(xué)物質(zhì)就會釋放神經(jīng)活性物質(zhì)，這樣就可以用光照的時間、亮度和照射位置來定時、定量、定位，控制神經(jīng)線路，并由釋放出的神經(jīng)活性物質(zhì)的性質(zhì)，來確定控制的結(jié)果是興奮還是抑制。
?光遺傳學(xué)以及離子通道原理簡圖。來源：Brown University
從上個世紀(jì)中期開始，微電極逐漸成為神經(jīng)科學(xué)研究的重要工具，它可以定點探測神經(jīng)電信號和激活神經(jīng)細(xì)胞。微電極是一種尖尖的針狀電極，尖端的直徑在0.1-100微米范圍，可以用于記錄或影響電極周圍小范圍的神經(jīng)細(xì)胞：在記錄時，它就像一只采訪麥克風(fēng)，只采集面前那個神經(jīng)細(xì)胞的電信號，而不顧周圍喧鬧的環(huán)境；而在刺激時，微電極像個導(dǎo)播用的耳機，只把信號傳給與它接近的神經(jīng)細(xì)胞。利用微電極技術(shù)就可以直接用電激活一個或一小群神經(jīng)細(xì)胞。通過激活神經(jīng)細(xì)胞，可以推測這些神經(jīng)細(xì)胞或者神經(jīng)回路的功能。
微電極技術(shù)在1950-2000年期間，成為最精確的神經(jīng)細(xì)胞操縱方式，然而卻遠(yuǎn)非理想，主要因為以下兩個問題：首先神經(jīng)細(xì)胞有興奮和抑制兩類，就像汽車的油門和剎車。在腦組織中，這兩類神經(jīng)細(xì)胞混合在一起，在給予電刺激的時候可能興奮抑制兩種細(xì)胞都被激活，就像油門剎車一起踩，效果不清楚。因此當(dāng)對一小群神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行刺激后，會觀察到一些改變，但這些結(jié)果是哪一個或哪些神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的，卻不清楚；
第二個問題是，在任何一個大腦的功能電路中有上億個神經(jīng)細(xì)胞，用微電極激活的一個神經(jīng)細(xì)胞或一小群神經(jīng)細(xì)胞，所起的作用有限。當(dāng)然人們可以加大電刺激以激活更多的神經(jīng)細(xì)胞，但這必然也會帶來靶點以外細(xì)胞的激活，產(chǎn)生更復(fù)雜甚至難以預(yù)料的結(jié)果。以上兩個問題綜合起來，就像在研究機器原理的時侯，只有錘子一樣，砸的力量小時沒任何作用，力量大可能產(chǎn)生相互抵制的作用（就像油門剎車一齊踩）；如果力量再大些，機器則不工作了，說不清到底是因為哪部分被破壞產(chǎn)生的效應(yīng)。
因此，人們需要一種可以特異性地調(diào)控一批神經(jīng)細(xì)胞的工具和方法，就像鉗子改錐和扳子，可以用來特異地拆解某些零件。然而神經(jīng)細(xì)胞很小，用于神經(jīng)細(xì)胞的工具就要比鉗子改錐和扳子更先進(jìn)，要求能在顯微尺度上自己到達(dá)需要研究的部位。遺傳工程學(xué)手段可以滿足這些苛刻的要求，把光敏蛋白裝置到需要研究的細(xì)胞上，而利用光來控制光敏感蛋白分子，就能實現(xiàn)定時定量和定點控制的要求。光遺傳學(xué)就是這么一門巧上加巧的技術(shù)。
下面我們來拆解光遺傳學(xué)的兩個關(guān)鍵技術(shù)。一是遺傳工程：每個細(xì)胞都帶著一份DNA藍(lán)圖，在生命的每一時刻，當(dāng)細(xì)胞需要一些零件時，藍(lán)圖的一部分就被抄下，用于制造零件。遺傳工程就是修改DNA藍(lán)圖的技術(shù)。如果你能篡改DNA藍(lán)圖，把一個對光敏感的蛋白分子設(shè)計圖加進(jìn)去，那么當(dāng)這個設(shè)計圖被細(xì)胞抄寫，并執(zhí)行時，就會自動造出對光敏感的蛋白分子，這樣用光就可以直接控制細(xì)胞的活動。那么怎樣篡改DNA藍(lán)圖呢？方法有很多，最傳統(tǒng)的辦法就是利用病毒。在生命進(jìn)化過程中，病毒早已發(fā)明出DNA篡改術(shù)，可把宿主細(xì)胞的DNA切斷，插進(jìn)一段代碼，這就類似用你的計算機（細(xì)胞）跑我的程序（病毒代碼）。當(dāng)然我們會事先拆解病毒，把有害的代碼去掉，添上制造光敏蛋白的代碼，當(dāng)病毒感染神經(jīng)細(xì)胞后，就會自動制造光敏蛋白了。除了病毒，科學(xué)家還在不斷地開發(fā)更精確更高效的技術(shù)。比如，兩位最近兩位在基因編輯領(lǐng)域非?；鸬目茖W(xué)家——MIT的張鋒和河北科技大學(xué)的韓春雨，分別開發(fā)了CRISPR和NgAgo技術(shù)，為切割DNA的精準(zhǔn)刀鋒帶來了場及時春雨。（請參見《韓春雨：“一鳴驚人”的中國科學(xué)家發(fā)明世界一流新技術(shù)》一文）
第二個核心技術(shù)是光敏蛋白。這個也是純天然有機物質(zhì)。生物進(jìn)化出了眼睛，從此世間有了陽光。光敏蛋白實際上是可以用光開關(guān)的離子通道。神經(jīng)系統(tǒng)可以被看做是一個高度復(fù)雜的電路系統(tǒng)。其中每個神經(jīng)細(xì)胞都像個小電池一樣，靜靜地儲蓄電能，然后利用電能處理及傳輸信號。蓄電的過程需要依靠細(xì)胞膜上鑲嵌的幾種蛋白分子，如“泵”和離子通道來進(jìn)行。通過控制離子跨細(xì)胞膜的流量，來控制電荷的積累，產(chǎn)生靜息態(tài)下的膜負(fù)電位。在靜息時遇到神經(jīng)遞質(zhì)等激活信號時，正離子通過通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化；到達(dá)一定閾值時，將觸發(fā)動作電位，鈉離子快速內(nèi)流，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞膜的電壓，并沿著細(xì)胞膜、順著軸突產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，最終帶來神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，激活或抑制相鄰的神經(jīng)細(xì)胞。因此，電信號被用來傳輸神經(jīng)信號和運算的介導(dǎo)。如果用光可以打開離子通道，就會讓細(xì)胞外的正離子洶涌流入，改變了靜息電位并引起動作電位。這樣，光子雖小卻可以四兩撥千斤，激活神經(jīng)細(xì)胞。（對“泵”、離子通道、靜息和動作電位的介紹參見“知識分子”的前文《從磁場感受器說起:生物感受器的“四兩撥千斤”》）。
當(dāng)微生物的光敏離子通道（channelrhodopsin）ChR1和ChR2蛋白被發(fā)現(xiàn)之后，一些敏銳的神經(jīng)科學(xué)家馬上意識到，如果可以將這種通道蛋白用遺傳工程的方法，轉(zhuǎn)到神經(jīng)細(xì)胞里，那么就可能通過光照來改變神經(jīng)細(xì)胞的活性。
2005年，斯坦福大學(xué)的卡爾·德塞羅斯（Karl Deisseroth）和愛德華·博伊登（Edward Boyden）等人第一次將ChR2蛋白表達(dá)在了哺乳動物的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)藍(lán)光可以準(zhǔn)確地控制神經(jīng)細(xì)胞的活動[2]。
此后，細(xì)菌視紫質(zhì)（Bacteriorhodopsin）與鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)（Halorhodopsin）都被順利地表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞中[3,4]。鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)是一種副離子通道，當(dāng)被光打開時大量氯離子涌入細(xì)胞，會降低靜息電位，產(chǎn)生抑制作用。這樣，人們可以通過不同的光來激活或抑制特定的神經(jīng)細(xì)胞。隨著光遺傳學(xué)社區(qū)的無私分享與廣泛合作，構(gòu)建于光遺傳學(xué)之上的材料和方法層出不窮，光遺傳學(xué)技術(shù)迅速席卷整個神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。
光遺傳學(xué)還是一項年輕的技術(shù)，談臨床應(yīng)用似乎顯得太早。但其實從誕生不久起，神經(jīng)科學(xué)界對光遺傳學(xué)應(yīng)用于臨床的探索就沒有停止過。
例如2006年，美國韋恩州立大學(xué)華人科學(xué)家潘卓華教授（Zhuo-Hua Pan）實驗室，將ChR2蛋白表達(dá)于感光細(xì)胞退化的小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)，使其獲得了編碼光信號的能力[5]。雖然這項研究并沒有像德塞羅斯等人的研究那樣給神經(jīng)科學(xué)界帶來重大革新，但其在光遺傳學(xué)初始階段就應(yīng)用于治療疾病，領(lǐng)先于他人。
作為一名視覺研究專家，潘卓華意識到眼睛可能是光遺傳學(xué)最容易應(yīng)用的區(qū)域，因為眼睛不僅是感光器官，對光的反應(yīng)敏感，基因療法在眼睛上比較容易操作，因為眼球直接暴露在體表。而且作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，眼睛有一定的免疫豁免特性。同時也不需要能發(fā)出光線的額外硬件，因為眼睛就是暴露在光下的。隨后，RetroSense Therapeutics公司與潘教授合作探索使用光遺傳學(xué)臨床治療失明，并于2015年成功拿到了美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）的臨床試驗批準(zhǔn)，可在視網(wǎng)膜色素變性的患者身上，測試基于光遺傳學(xué)的治療方法。
?視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis Pigmentosa）。來源：gallery4share.com
視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis Pigmentosa）是一種遺傳性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退化疾病，與大約50多種基因突變有關(guān)，目前在全球約有150多萬名患者。這些患者的視網(wǎng)膜上負(fù)責(zé)夜晚視覺的視桿感光細(xì)胞先死亡，負(fù)責(zé)白天視覺的視錐細(xì)胞隨后死亡，使他們漸漸失去視覺。
目前，對于視網(wǎng)膜色素變性還沒有有效的藥物或手段進(jìn)行康復(fù)性治療，延緩感光細(xì)胞死亡進(jìn)程治療方法倒是有幾種：第一種方法是將單克隆抗體Ranibizumab注射到眼睛里，每兩周注射一次。它可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），具備一定光感受器保護(hù)作用，但并不十分有效，第二種是針對基因RPE65突變造成視網(wǎng)膜色素變性的患者，Spark Therapeutics公司進(jìn)行的基因療法臨床試驗顯示出不錯的效果，但可治療的人群范圍太窄，而且對已經(jīng)完全失明的人來說沒有用。第三種方法是用仿生眼替換眼睛，目前的仿生眼技術(shù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)談不上成熟，既昂貴又麻煩，還不美觀，恢復(fù)的視力也非常弱。
RetroSense公司的光遺傳學(xué)治療，將含有光敏感通道DNA的病毒載體注射進(jìn)入眼睛玻璃體中央，視網(wǎng)膜的最內(nèi)層細(xì)胞——神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可被病毒所感染。一旦病毒載體將光敏感通道DNA介導(dǎo)進(jìn)入神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，且神經(jīng)節(jié)細(xì)胞開始制造光敏蛋白，它們就會在光線作用下被激活，也就是說，重新對外界光線起反應(yīng)。RetroSense公司希望在視網(wǎng)膜上可以造出超過10萬的光敏感細(xì)胞，使患者至少能看到桌子和椅子以及大一點的字母，而目前的仿真眼只能讓患者一次獲得幾個像素的視覺信息。
2016年3月，RetroSense公司正式開始實施視網(wǎng)膜色素變性的光遺傳學(xué)臨床試驗RST-001項目，并成功完成了第一例病人的實驗，這也是世界上首例光遺傳學(xué)臨床治療。這項臨床研究共分為兩部分，第一部分的目標(biāo)在于決定實驗所用試劑的濃度是否安全，患者是否耐受；第二部分將在最高劑量耐受組中獲取更多的安全性數(shù)據(jù)，為今后的臨床試驗設(shè)計提供數(shù)據(jù)支持。
光遺傳學(xué)有了第一例臨床試驗，接下來就會越來越多。除了視覺以外，還有許多其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病亟待治療。
2010年成立的初創(chuàng)公司Circuit Therapeutics就計劃將光遺傳學(xué)應(yīng)用于神經(jīng)疾病的治療中。第一步目標(biāo)是慢性疼痛治療，以取代那些需要腦深部刺激的療法。因為受慢性疼痛影響的神經(jīng)細(xì)胞就在脊髓外側(cè)，比腦深部的神經(jīng)細(xì)胞更容易接近，在早期的動物實驗中，他們成功地將光敏感通道蛋白表達(dá)于痛覺相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞中，并關(guān)閉了痛覺產(chǎn)生的通路。在注射含有光敏感通道蛋白DNA的病毒進(jìn)入外周神經(jīng)細(xì)胞的2周后，光敏通道蛋白就可以在其中穩(wěn)定地表達(dá)。這種光敏感通道蛋白與治療失明所用的蛋白不同，其效果剛好相反，用光照亮皮膚時，這種光敏感通道抑制了痛覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的活動，從而使痛覺感受和熱敏感性顯 著降低，而這兩個問題正是最讓慢性疼痛患者煎熬的問題。雖然人體試驗尚未進(jìn)行，但可以預(yù)測其成功的可能性很高。
與之類似，不少機構(gòu)也在嘗試用光遺傳學(xué)治療帕金森等更多的神經(jīng)疾病。
?研究者通過小鼠的光遺傳實驗，研究如何降低人類的可卡因成癮。來源：Nat Neurosci, 2016
光遺傳學(xué)除了主導(dǎo)治療之外，還可以作為一種輔助手段。
最近，意大利的一項臨床試驗在光遺傳學(xué)的指導(dǎo)下，結(jié)合經(jīng)顱磁刺激（Transcranial magnetic stimulation ，TMS）進(jìn)行可卡因戒毒臨床治療[6]。由于之前有研究發(fā)現(xiàn)，“吸毒”大鼠的前邊緣皮層（Prelimbic Cortex）活性降低，通過光刺激光敏感通道，激活這個區(qū)域后，尋找毒品的行為減少。于是這個意大利的臨床試驗就在人身上進(jìn)行了探索，把光遺傳學(xué)方法換成了更為無創(chuàng)的TMS。由于人腦的背外側(cè)前額葉皮層（Dorsolateral Prefrontal Cortex，DLPFC）執(zhí)行與大鼠前邊緣皮層類似的功能，而且定位于人腦表面，易于TMS刺激，結(jié)果也令人振奮：69%的癮君子，在TMS治療期間沒有復(fù)吸，而藥物治療的對照組這一比例只有19%。10個藥物治療組的患者，轉(zhuǎn)入TMS組后，藥物治療時原本有8個復(fù)吸，經(jīng)過TMS治療后，只有3個復(fù)吸。單純的藥物治療和腦部刺激經(jīng)常帶來脫靶效應(yīng)（作用的靶點與期望的不一致），且精確度不高。與臨床更可行的治療方法相比，光遺傳學(xué)和神經(jīng)回路機制指導(dǎo)的治療方案，會實現(xiàn)更好的效果[7]。
盡管光遺傳學(xué)進(jìn)展十分迅速，但仍處于發(fā)展階段。在它的前十年中，相比神經(jīng)細(xì)胞、突觸等領(lǐng)域劃時代的發(fā)現(xiàn)，光遺傳學(xué)還沒有為神經(jīng)科學(xué)帶來根本性的突破。光遺傳學(xué)目前所做的事情只是讓神經(jīng)回路更易操縱，明確某些神經(jīng)細(xì)胞對某神經(jīng)回路的意義，或者是探索細(xì)胞類型與特定回路之間的關(guān)系[8]。
在臨床應(yīng)用中，光遺傳學(xué)同樣面臨不少問題。從理論基礎(chǔ)上看，我們對人腦細(xì)胞的類型只有很粗略的分類，這讓治療缺乏特異且明確的目標(biāo)。對視網(wǎng)膜色素變性的治療之所以能成為第一個光遺傳學(xué)治療研究，這與我們對視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的精確了解是分不開的。
從技術(shù)層面上說，光遺傳學(xué)也面臨兩個挑戰(zhàn)，一方面是光敏蛋白基因的導(dǎo)入，無論是轉(zhuǎn)基因還是病毒移植，如何有效地定位目標(biāo)靶點，不觸發(fā)人體的生理反應(yīng)，如免疫反應(yīng)等，如何讓光敏蛋白基因在神經(jīng)細(xì)胞中穩(wěn)定、持續(xù)地表達(dá)，保證其長期的安全性，這些都是需要注意的問題；另一方面，則是如何安置光源，與視網(wǎng)膜不同的是，大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞都在大腦深部，光源難以到達(dá)，如何讓光源設(shè)備盡量小型化、可植入且易供電，是設(shè)備設(shè)計方面需要考慮的問題[9]。
隨著美國、歐洲以及日本腦計劃的實施，技術(shù)方面的難題正在逐步地解決。光遺傳學(xué)社區(qū)一直以來的共享精神和快速發(fā)展的傳統(tǒng)，相信會在短期內(nèi)解決一系列光遺傳學(xué)應(yīng)用于臨床的技術(shù)難題。未來會是怎樣，誰也無法預(yù)計，也許到時候很多人身上都有小開關(guān)，開關(guān)神經(jīng)細(xì)胞就像開關(guān)燈那樣簡單。
參考文獻(xiàn)
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