基因治療病毒載體有毒？這種方法可降低對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性
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隨著生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)的發(fā)展，基因治療逐漸走進(jìn)人們的視野?；蛑委熤饕轻槍?duì)那些難以用化學(xué)藥物根治的、對(duì)人類(lèi)健康存在威脅的疾病，包括遺傳病（如脊肌萎縮癥、地中海貧血癥）、惡性腫瘤、心血管疾病、阿爾茨海默癥與免疫缺陷等。
目前，許多體內(nèi)基因治療的方法都是以腺相關(guān)病毒（AAV）為載體。腺相關(guān)病毒是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單鏈DNA缺陷型病毒，通常需要輔助病毒的幫助才能產(chǎn)生毒性?；蛑委熗ǔ⒅委熜缘霓D(zhuǎn)基因或基因編輯工具包裝進(jìn)腺相關(guān)病毒，然后將之遞送至患者靶細(xì)胞核內(nèi)，隨后腺相關(guān)病毒內(nèi)部編碼病毒蛋白的DNA將被刪掉，取而代之的是治療性轉(zhuǎn)基因，從而實(shí)現(xiàn)基因治療。
雖然AAV在應(yīng)用于基因治療時(shí)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但在治療神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病時(shí)有潛在的致病性，會(huì)導(dǎo)致新的問(wèn)題。已有的研究表明，無(wú)論是將AAV載體通過(guò)靜脈注射入豬的血液中 [1]，還是將其通過(guò)小腦延髓池穿刺（ICM）注入非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的腦脊液中 [2,3]，都會(huì)對(duì)動(dòng)物的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）產(chǎn)生嚴(yán)重毒性，這種毒性會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重時(shí)甚至可產(chǎn)生共濟(jì)失調(diào)癥。
針對(duì)此問(wèn)題，來(lái)自美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的詹姆斯·M·威爾森（James M·Wilson）教授開(kāi)發(fā)出一種新的方法，避免在使用AAV作為載體治療此類(lèi)疾病時(shí)對(duì)背根神經(jīng)節(jié)的毒性。該方法于11月11日發(fā)表在《科學(xué)-轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》（Science Translational Medicine）雜志上 [4]。
我們先來(lái)了解一下背根神經(jīng)節(jié)為什么會(huì)因AAV載體 “中毒”。背根神經(jīng)節(jié)是一種聚集在脊髓外側(cè)的感覺(jué)神經(jīng)元（圖1.A），對(duì)AAV載體有著特殊的親和力。因此，這些神經(jīng)細(xì)胞被過(guò)多AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后會(huì)進(jìn)行超負(fù)荷的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激，使衛(wèi)星細(xì)胞反應(yīng)性增殖并分泌細(xì)胞因子，繼而吸引淋巴細(xì)胞，這一連串反應(yīng)最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖2）。
“隨著我們?cè)诨蛑委燁I(lǐng)域的不斷進(jìn)步，尤其是在治療非致命性疾病方面的進(jìn)步，我們會(huì)有一些安全顧慮，而這些安全顧慮將超過(guò)通過(guò)治療收獲的益處”，本研究的通訊作者威爾森說(shuō)。[5]
雖然藥物可以減輕機(jī)體對(duì)AAV載體和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)，但并無(wú)法消除其對(duì)背根神經(jīng)節(jié)的毒性和軸突病變 [2,3]。那么，是否可以通過(guò)某種方法來(lái)使這種情況得到改善呢？
為此，威爾森團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種新的方法，從而大大降低AAV載體對(duì)這種神經(jīng)細(xì)胞的毒性。
結(jié)合早期嘗試與對(duì)各種方法的評(píng)估，作者最終選定了以下方案：讓背根神經(jīng)節(jié)中的AAV載體沉默。
怎么才能讓背根神經(jīng)節(jié)精準(zhǔn)識(shí)別出AAV載體并阻止其表達(dá)呢？研究者決定在AAV載體中插入的特殊基因片段。我們知道，當(dāng)一般的編碼DNA想行使其功能時(shí)，會(huì)先轉(zhuǎn)錄為單鏈mRNA（信使RNA），才能被翻譯為蛋白質(zhì)。不過(guò)，miRNA（微小RNA）可以與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA的特定區(qū)域特異性結(jié)合，這樣一來(lái)，mRNA就形成了部分雙鏈，而這樣的mRNA會(huì)被機(jī)體降解掉，從而阻止其繼續(xù)翻譯成蛋白質(zhì)。
因此，研究團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)基因的終止密碼子和poly-A尾之間插入與背根神經(jīng)節(jié)中特有miRNA反向互補(bǔ)的四個(gè)重復(fù)序列（圖3）。如此一來(lái)，當(dāng)AAV攜帶的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，如果miRNA找到鏈條中與其互補(bǔ)的序列并與之結(jié)合，基因表達(dá)就終止了。四個(gè)重復(fù)序列可以增加其與背根神經(jīng)節(jié)中特異miRNA結(jié)合的概率，繼而加強(qiáng)其抑制效率，組成一個(gè)用于在背根神經(jīng)節(jié)中沉默AAV的表達(dá)盒（expression cassette）。這樣的表達(dá)盒不僅可以通過(guò)miRNA的特異性識(shí)別來(lái)沉默轉(zhuǎn)基因在背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)，而且在其它不表達(dá)特異性miRNA的細(xì)胞類(lèi)型中，蛋白質(zhì)合成也不會(huì)受到影響。
作者最終選擇了一個(gè)在背根神經(jīng)節(jié)中特異性很高的 miRNA183（簡(jiǎn)稱miR183）的反向重復(fù)序列作為表達(dá)盒的插入序列。
表達(dá)盒設(shè)計(jì)好了，它的療效如何呢？
研究團(tuán)隊(duì)首先用恒河猴測(cè)試了在AAV載體加入特定片段后，是否會(huì)減輕對(duì)背根神經(jīng)節(jié)的毒性。通過(guò)小腦延髓池穿刺，研究人員將表達(dá)GFP（綠色熒光蛋白）或 GFP-miR183 的AAV載體注射進(jìn)成年恒河猴體內(nèi)，在第14天對(duì)半數(shù)動(dòng)物進(jìn)行尸檢，檢測(cè)GFP的表達(dá)量；在第60天處死剩余動(dòng)物，評(píng)估GFP的表達(dá)量與背根神經(jīng)節(jié)毒性。并且，猴子們?cè)诮邮蹵AV注射后，均沒(méi)有證據(jù)表明其獲得神經(jīng)性頭痛等臨床后遺癥。
結(jié)果如圖4所示，含有miR183靶標(biāo)的改造載體與對(duì)照載體相比，熒光蛋白的表達(dá)量在背根神經(jīng)節(jié)中顯著降低，而在腰椎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和小腦中顯著提高，在大腦皮質(zhì)中則無(wú)明顯變化。這些現(xiàn)象意味著，含有miR183靶序列載體的蛋白表達(dá)僅在背根神經(jīng)節(jié)中受到了抑制，而在其它神經(jīng)組織中并未受到抑制。并且當(dāng)載體中不含有miR183靶位點(diǎn)時(shí)，所有區(qū)域都存在病理現(xiàn)象。
之后，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)試了加入特定序列后，AAV載體的基因治療效果如何。作者使用了表達(dá)hIDUA的載體進(jìn)一步評(píng)估了在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中miR183靶序列的作用。hIDUA是黏多糖病I型患者體內(nèi)缺乏的酶，有關(guān)這一基因的研究首次報(bào)道了非人靈長(zhǎng)類(lèi)中的背根神經(jīng)節(jié)毒性 [3]。
實(shí)驗(yàn)分為三組，第一組動(dòng)物僅注射表達(dá)hIDUA的載體；第二組在第一組的基礎(chǔ)上加入類(lèi)固醇藥物進(jìn)行治療；第三組在表達(dá)hIDUA的載體中整合入miR183靶序列。在第90天處死所有動(dòng)物，評(píng)估hIDUA的表達(dá)量與背根神經(jīng)節(jié)毒性。
結(jié)果顯示，在第一組和第二組的背根神經(jīng)節(jié)中檢測(cè)到hIDUA的高表達(dá)量，在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其它區(qū)域檢測(cè)到低至中度的hIDUA表達(dá)。而在第三組中，將miR183靶序列整合入載體后，不僅阻斷了背根神經(jīng)節(jié)中hIDUA蛋白的表達(dá)，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)中hIDUA蛋白的表達(dá)量沒(méi)有降低。第三組動(dòng)物在背根神經(jīng)節(jié)、脊柱和周?chē)窠?jīng)區(qū)域完全沒(méi)有出現(xiàn)病理現(xiàn)象，而第一組和第二組動(dòng)物則恰恰相反、存在病理現(xiàn)象。
以上數(shù)據(jù)與現(xiàn)象共同說(shuō)明，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的方法可以在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中減輕基因治療過(guò)程中AAV載體誘導(dǎo)的背根神經(jīng)節(jié)毒性，并且在此基礎(chǔ)上不會(huì)降低基因治療的效果。
“我們能夠在保證病毒載體效力的情況下降低或消除其背根神經(jīng)節(jié)毒性”，威爾森說(shuō)，“基因治療目前正在對(duì)21種不同的疾病進(jìn)行臨床試驗(yàn)，另有122種疾病正在進(jìn)行臨床前研究。在這21種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的治療中，有14種可能具有背根神經(jīng)節(jié)毒性，而這種改良的AAV載體可能會(huì)使該現(xiàn)象有所改善?！?[5]
威爾森的研究小組已經(jīng)同意將這項(xiàng)技術(shù)授權(quán)給五家基因治療公司，并正在與另外五家公司進(jìn)行談判。這種改良技術(shù)目前并未應(yīng)用于臨床，但作者說(shuō)他希望明年就能實(shí)現(xiàn)對(duì)此技術(shù)的臨床應(yīng)用。
“這項(xiàng)研究使AAV基因治療向臨床應(yīng)用邁出重要的一步?！?來(lái)自南安普頓大學(xué)神經(jīng)再生領(lǐng)域的科學(xué)家梅利莎·安德魯斯（Melissa Andrews）這樣評(píng)論該研究，“這種方法看起來(lái)并不會(huì)降低基因治療的療效，而且作為一種更為安全的治療措施，它將受到臨床治療的歡迎?！?[5]
