中國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)的迷你版CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)，有何精巧之處？
CRISPR-Cas系統(tǒng)是當(dāng)前基因編輯領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的生物技術(shù)| 圖源：pixabay.com
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CRISPR-Cas系統(tǒng)是當(dāng)前基因編輯領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的生物技術(shù)。2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予德國(guó)馬克斯普朗克研究所教授Emmanuelle Charpentier和美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校教授Jennifer A. Doudna，以表彰她們?cè)诨蚓庉?/span>（CRISPR/Cas9）領(lǐng)域做出的開創(chuàng)性工作。
現(xiàn)有的CRISPR-Cas系統(tǒng)可以分為兩類，主要區(qū)分點(diǎn)就是Cas蛋白的不同。因?yàn)檩^高的編輯效率，CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a是現(xiàn)在最常用的基因編輯工具。
CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的主要原理是通過一個(gè)叫向?qū)NA（guide-RNA，gRNA）的核酸片段在宿主基因組找到要進(jìn)行基因編輯的位置，也就是靶向DNA序列，然后通過Cas蛋白對(duì)DNA進(jìn)行切割。在實(shí)際操作中，我們會(huì)把編碼Cas蛋白的核酸片段連接到一種遞送載體（例如質(zhì)粒、腺相關(guān)病毒等），通過載體 “運(yùn)” 進(jìn)細(xì)胞，然后再一步步表達(dá)成最終發(fā)揮效應(yīng)的Cas蛋白。
CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的編輯效率高，但也存在局限。構(gòu)成Cas9和Cas12a蛋白的氨基酸數(shù)量均超過1000，也就是說編碼這兩種效應(yīng)蛋白的核苷酸（對(duì)）數(shù)量均大于3000。把這么多的核苷酸有效包裝進(jìn)一些遞送系統(tǒng)顯得有些困難。例如，腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)的最大承載量是4700個(gè)核苷酸，比編碼釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9的基因（4200個(gè)核苷酸）長(zhǎng)不了多少 [3]，根本沒有空間組裝其他調(diào)控元件。
正因此，尋找 “體格” 比較小，但仍能發(fā)揮 “剪刀” 功能的Cas效應(yīng)蛋白是很多課題組的研究方向。
Jennifer A. Doudna團(tuán)隊(duì)先后發(fā)現(xiàn)兩種小型的、可以對(duì)人類細(xì)胞基因組進(jìn)行編輯的Cas效應(yīng)蛋白：CasX（Cas12e，986個(gè)氨基酸）和CasF（Cas12j，700~800個(gè)氨基酸）[4, 5]。
在此之前，該課題組還發(fā)現(xiàn)一種更小的名為Cas14a1【從非培養(yǎng)古細(xì)菌（Uncultured archaeon）獲得，因此又名Un1Cas12f1，400~700個(gè)氨基酸】的效應(yīng)蛋白可以切割單鏈DNA [6]。來自立陶宛維爾紐斯大學(xué)（Vilnius University）生物技術(shù)研究所的 Virginijus Siksnys 團(tuán)隊(duì)則進(jìn)一步證實(shí)Cas12f還具有切割雙鏈DNA的能力 [7]。
可以說，Cas12f是迄今鑒定出的最小的具有基因編輯潛力的Cas蛋白。
那么，從其他細(xì)菌獲得的Cas12f是否具有基因編輯的能力呢？Un1Cas12f1能否編輯哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組呢？換句話說，這些 “迷你”Cas蛋白是否能應(yīng)用于基因編輯？
2021年9月2日，上?？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授季泉江團(tuán)隊(duì)在《自然·化學(xué)生物學(xué)》（Nature Chemical biology）發(fā)表文章，系統(tǒng)闡述了該團(tuán)隊(duì)對(duì)Cas12f1功能的研究 [8]。
因?yàn)檠芯克玫木幋aCas12f1的基因從一種名為Acidibacillus sulfuroxidans 的嗜熱細(xì)菌中獲得，該團(tuán)隊(duì)將其命名為AsCas12f1，其長(zhǎng)度只有422個(gè)氨基酸。研究人員首先通過一系列生化實(shí)驗(yàn)證明AsCas12f1在向?qū)NA的指引下進(jìn)行雙鏈DNA的切割。進(jìn)一步的，該團(tuán)隊(duì)確定CRISPR -AsCas12f1可以對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的基因組進(jìn)行編輯，編輯效率與經(jīng)典Cas9不相上下，最高可以達(dá)到100%。
而在人類細(xì)胞（HEK293細(xì)胞，一種模式細(xì)胞）進(jìn)行基因編輯檢測(cè)后，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CRISPR-AsCas12f1的編輯效率最高在30%左右，低于Cas9、Cas12a等。但令人欣喜的是，AsCas12f1可以通過包括質(zhì)粒和腺相關(guān)病毒在內(nèi)的多種遞送系統(tǒng)發(fā)揮功能。
“不論是AsCas12f1自身，還是改造出的一些衍生基因編輯工具，我覺得都可以應(yīng)用在疾病治療方面，比如說遺傳性疾病，感染性疾病的治療。另一個(gè)就是可以改造成核酸檢測(cè)的工具。” 論文通訊作者季泉江接受《知識(shí)分子》采訪時(shí)表示。
針對(duì)目前AsCas12f1在人類細(xì)胞中編輯效率不如Cas9的問題，季泉江表示，他們準(zhǔn)備通過分子進(jìn)化的方法進(jìn)行改進(jìn)。與此同時(shí)，也會(huì)基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)其進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，或者利用隨機(jī)突變找到功能更好的蛋白。
“比如我們的蛋白結(jié)合核酸的能力相比Cas9較弱，那就可以針對(duì)這一問題做些改造，把跟核酸結(jié)合區(qū)域的這些氨基酸突變成帶正電的氨基酸，這樣就可以與帶負(fù)電的核酸有更強(qiáng)的結(jié)合能力；再比如可以通過引入一些額外的相互作用，改變它對(duì)PAM的識(shí)別，拓展識(shí)別范圍?！?span style="font-size: 16px;letter-spacing: 1px;">季泉江說。
9月3日，另外一個(gè)團(tuán)隊(duì)則報(bào)告了對(duì)于優(yōu)化了的Un1Cas12f1的研究。
來自韓國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) Yong-Sam Kim 和同事通過對(duì)CRISPR-Cas12f1系統(tǒng)的原始向?qū)NA進(jìn)行了5個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)化，提升了Un1Cas12f1的編輯效率。并且，經(jīng)過優(yōu)化的CRISPR-Cas12f1可以通過質(zhì)粒和腺相關(guān)病毒等途徑進(jìn)入人類細(xì)胞，進(jìn)行基因編輯 [9]。
簡(jiǎn)單地講，不管是Un1Cas12f1還是AsCas12f1，這些個(gè)頭只有Cas9和Cas12a一半的效應(yīng)蛋白，同樣具有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因編輯的能力，并且和腺相關(guān)病毒載體這種臨床研究中常用的器官靶向基因治療遞送系統(tǒng)很 “般配”。效應(yīng)蛋白小，就能給遞送系統(tǒng)騰出更多空間安裝其他調(diào)控原件，提升基因治療的效率，未來也將具有更廣闊的的應(yīng)用前景。
制版編輯 | 盧卡斯
