一個“異端邪說”是如何一步步走到聚光燈下？
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撰文 | 黃宇翔
責編 | 葉水送
問細胞核內，誰主沉?。?/span>
1962年，一篇發(fā)表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）的論文吸引了洛克菲勒大學教授Vincent Allfrey的注意力。
加州理工學院James Bonner實驗室的黃周汝吉從豌豆種子的胚軸純化出DNA、組蛋白以及RNA聚合酶的粗提物，在試管中證明組蛋白的加入會顯著降低DNA的轉錄速率，從而得出組蛋白抑制RNA合成的結論。[1]（黃周汝吉分離出的DNA和組蛋白相對純凈，但RNA聚合酶僅僅是粗提物。RNA聚合酶的真正純化是由生化學家Robert Roeder在1969完成的。）
Allfrey圍繞組蛋白對基因轉錄調節(jié)已經(jīng)開展了多年的研究，同行新得出的證據(jù)令他感到十分振奮。
與此同時，倫敦癌癥研究所（Institute of Cancer Research）的英國科學家D.M.P. Philips在長期研究小牛胸腺細胞組蛋白氨基酸組成的探索過程中，發(fā)現(xiàn)組蛋白的N端豐富的賴氨酸和精氨酸區(qū)域存在豐富的乙?；鶊F——一種由二碳單位組成的官能團修飾。[2]（Allfrey精確地測算了每個核小體中乙?；鶊F的數(shù)目，甚至還在七十年代發(fā)現(xiàn)一種有機酸可以抑制去乙?；倪^程——這表明組蛋白的乙酰化修飾可能被精確調控，并且該平衡可能具有重要生物學意義。但受限于技術的限制，Allfrey既不能證明組蛋白乙?；揎棇τ诩毎杏绊?，也沒能鑒定出添加、去除組蛋白乙?；揎椀拿?，這兩項工作分別由后世的Grunstein、Allis、Stuart Schreiber等人接力完成。）
這不禁引發(fā)了Allfrey的思考：這些乙酰基團的修飾可能具有哪些功能呢？
為了回答這個疑問，Allfrey做了一個實驗：他向小牛胸腺的核提取物中加入組蛋白，和他以前的觀察一致，核提取物中RNA轉錄的速率被顯著抑制。但如果在提取組蛋白之前先用醋酸處理獲得具有豐富乙?；揎椀慕M蛋白 ，神奇的一幕發(fā)生了：乙?；慕M蛋白對核提取物的轉錄抑制效果輕微了許多。
“組蛋白修飾可能是一種激活/抑制RNA合成的調節(jié)機制?！盇llfrey在發(fā)表這一實驗的討論部分謹慎地寫道。[3]
Allfrey基于化學原理進行分析，認為帶有正電性的組蛋白之所以能抑制轉錄，很可能是因為結合了帶有負電的DNA分子，進而阻礙RNA聚合酶對DNA進行轉錄；而乙?；鶊F的添加恰恰抵消了組蛋白上的正電荷，因此降低了組蛋白與DNA的結合，從而消除了其對轉錄的抑制效果。
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在接下來的十幾年里，Allfrey和他的學生們試圖為這一假說尋找具有生理學意義的證據(jù)：他們在馬血、鼠肝和果蠅的唾液腺中都觀察到了隨組蛋白乙酰化程度升高DNA轉錄速率升高的現(xiàn)象。[4-6]
但這些結果都只能說明組蛋白乙?；cDNA轉錄有很強的關聯(lián)性，并不能從中推導出兩者在因果上存在直接的相互作用。
因此，盡管Allfrey苦苦堅持，不斷增添著定量、描述性的證據(jù)，組蛋白乙?；瘺Q定轉錄活性的觀點在很長一段時間里在主流的分子生物學家眼中都只是個“異端邪說”。
七十年代，研究者通過電鏡看到了組蛋白和DNA的結合：DNA就像一條項鏈一樣纏繞在組蛋白上，Roger Kornberg將這一結構命名為“核小體”（nucleosome）。[9,10]
對于一名七十年代的生物學家來說，組蛋白僅僅是用來將DNA纏繞濃縮、裝進細胞核內的“集裝箱”，沒有太多值得去研究的意義。相比于染色質的結構，轉錄因子、RNA聚合酶才是聚光燈下的真正主角。
對基因調控感興趣的研究者們對于轉錄因子、RNA聚合酶的研究趨之若鶩，而組蛋白的門前卻無人問津。
七十年代末，幾乎沒有人注意到，一位名叫Michael Grunstein的年輕人悄無聲息地踏入了組蛋白這片近乎荒蕪的科學大陸。
在愛丁堡大學讀博期間，Grunstein在Max Birnstiel教授的指導下圍繞核糖體基因功能展開研究，對基因的表達產(chǎn)生了濃厚興趣，于是在博士畢業(yè)以后來到美國斯坦福大學，在Laurence Kedes實驗室研究組蛋白的合成。
盡管組蛋白不被基因調控的研究者看好，但對于研究蛋白合成來說卻是個不錯的實驗對象：Kedes教授基于海膽卵在發(fā)育過程中會大量合成組蛋白的特性，通過研究不同亞型組蛋白mRNA與蛋白質的對應關系，為中心法則提供了新的例證。[11]
1975年，Grunstein受聘為加州大學洛杉磯分校（UCLA）助理教授，目標通過海膽卵研究發(fā)育過程中不同亞型組蛋白各自的調控機制。[12]
隨著研究的開展，海膽卵系統(tǒng)的不足逐漸凸顯出來：海膽卵細胞中多達上百份的組蛋白編碼基因拷貝固然為組蛋白的純化提供了便利，但要想從機制上論證不同亞型組蛋白對細胞功能的影響，就顯得捉襟見肘了。
Grunstein面臨著和Allfrey相似的困境：如何才能從功能上研究組蛋白的作用呢？
1979年，一場由厄爾尼諾現(xiàn)象帶來的風暴，徹底打亂了Grunstein原本的研究計劃。
氣候變化導致太平洋海域的無機鹽成分減少，近海的海膽數(shù)量因此驟降。巧婦難為無米之炊，他不得不轉向其他的實驗材料。[13]
1978年發(fā)表的一篇PNAS論文吸引了他的注意力：康奈爾大學的Gerald Fink團隊成功實現(xiàn)向酵母細胞轉入外源的DNA，并且能利用酵母細胞內部的同源重組機制實現(xiàn)基因的靶向敲除。[14]
與此同時，布蘭迪斯大學的Lynna Hereford和弗吉尼亞大學的Mitchell Smith先后確定酵母細胞中4種常見組蛋白（H2A、H2B、H3和H4）各含有兩個拷貝。[15]
有沒有可能在酵母中敲除特定的組蛋白亞型的兩條拷貝，觀察對細胞生長、基因表達的影響呢？Grunstein立刻報名參加了由Gerald Fink組織的酵母遺傳學培訓課程，從零開始學習酵母的實驗操作方法。實驗室的研究生John Wallis和Mary Rykowski率先對組蛋白H2B進行分析，確認酵母中的兩份H2B拷貝（H2B-1和H2B-2）序列同源、功能互補，任何一個存在都能支持酵母的正常生長。[16,17]
在接下來的幾年里，Grunstein的團隊穩(wěn)扎穩(wěn)打，利用酵母遺傳學手段對組蛋白的各個亞型逐個進行分析，終于由來自中國的留學生韓珉完成臨門一腳，在敲除組蛋白H4后發(fā)現(xiàn)了RNA轉錄的顯著上調，一舉回答了那個困擾Allfrey幾十年的懸案。[18]
組蛋白在體內的確會抑制基因的表達！并且韓珉等人還發(fā)現(xiàn)，組蛋白H4的N端富含賴氨酸的片段在各物種間都極為保守，選擇性地敲除這一片段不會影響酵母的生長，但特定基因的表達調控會被破壞。[19]
這不正是Allfrey在他模型中所設想的情景嗎？
很遺憾，在科學界，對于一項重要的發(fā)現(xiàn)，并不是所有人都能立刻意識到其背后蘊藏的深刻意義。
真理有時掌握在少數(shù)人手中。
有時候，在天將降大任于少數(shù)人時，他們需要為自己的堅持隱忍多年，甚至還可能會為此丟掉飯碗。
David Allis對此想必深有體會。
1988年，Grunstein實驗室發(fā)表選擇性移除H4組蛋白N端片段的實驗結果時，大多數(shù)人注意到的是對細胞生長沒有影響，而非基因轉錄活性的升高。
移除了組蛋白中發(fā)生乙?；某煞?，酵母還能生長得欣欣向榮，不正說明組蛋白的乙?；揎棇毎δ軟]什么重要的影響嗎？
貝勒醫(yī)學院生化系的系主任Salih Wakil至少是這么想的。
因此他對于系里那名叫Allis的年輕人對純化組蛋白乙?；傅膱?zhí)著感到難以理解。
Allis博士期間在印第安納大學Anthony Mahowald實驗室研究果蠅的發(fā)育問題。一個偶然的機會，讓他與染色質和組蛋白結緣。
在一門研究生文獻討論課程上，Allis被安排向同學們介紹近期Pierre Chambon教授利用電鏡觀察核小體結構的論文。在準備報告的過程中，他讀到了Allfrey圍繞組蛋白乙酰化所提出的模型。如果能找到特定添加、去除組蛋白乙酰化的酶就好了。他心中暗暗感嘆。
在文獻討論的過程中，Allis激情澎湃地向老師同學們講述組蛋白乙?；揎棻澈罂赡芴N藏的重要調控機制——但大家對此都無動于衷：在1975年，既沒有證據(jù)支持組蛋白在體內對細胞功能必要，也沒有多少人相信組蛋白的乙?；揎検墙?jīng)過嚴格調控的結果。[20]
但一旦認定染色質絕沒有人們想象得那么簡單，Allis就下定決心，將揭示組蛋白對基因表達的調控作用看作是值得自己投入精力去探索的科學問題。
可當他在1978年博士畢業(yè)的時候，找了一圈下來卻失望地發(fā)現(xiàn)：當時以果蠅為模式生物的實驗室并沒有興趣去研究染色質的結構問題，而研究染色質、核小體的實驗室又以他經(jīng)驗不足為理由將他拒之門外。
就在Allis為找博后過程中所遇到的挫折感到郁悶的時候，Anthony Mahowald實驗室一位名叫Kathy Karrer的博后師姐為他提供了一條建議。
“我聽說羅徹斯特大學有一個實驗室在用四膜蟲研究組蛋白的功能，沒準你可以去試試看?！?/span>
四膜蟲？那是什么生物？他從沒聽說過有人用這種生物做研究，甚至連“四膜蟲”（Tetrahymena）這個單詞也是頭一回聽說。
經(jīng)過認真的調研，Allis不僅搞清楚了四膜蟲這個單詞的拼寫，而且了解到這種長有很多纖毛的單細胞真核生物確實十分有趣：四膜蟲包含有兩個細胞核，其中較大的稱作“營養(yǎng)核”，能夠合成大量四膜蟲生活所需的蛋白質，而較小的稱作“生殖核”，相對沒那么活躍。
Martin Gorovsky團隊在將四膜蟲的兩種核進行純化后，發(fā)現(xiàn)其中的組蛋白組成存在著比較大的差異：其中轉錄活躍的營養(yǎng)核富含高度乙酰化的組蛋白，而轉錄相對沉默的生殖核則乙?；潭容^低。[21,22]
四膜蟲的營養(yǎng)核中組蛋白乙?；潭冗@么高，應該不乏乙?；傅拇嬖诎?？——Allis在心中盤算著從四膜蟲的營養(yǎng)核中純化出組蛋白乙酰化酶的可行性。
來到羅徹斯特之后，Allis通過二維電泳的方法對四膜蟲營養(yǎng)核與生殖核中不同亞型的組蛋白進行鑒別，并且進一步確定了營養(yǎng)核中組蛋白豐富的乙?；揎?，堅定了從營養(yǎng)核中分離組蛋白乙?；傅男拍睢?/span>[23-25]
1981年，Allis來到位于休斯頓的貝勒醫(yī)學院生化系，一心想要從四膜蟲的營養(yǎng)核中分離出的乙?；竵?。
七年的時光準瞬即逝，冷室中日夜的純化工作讓Allis 從上百升四膜蟲培養(yǎng)液中終于得到了在體外能具有乙?；富畹慕M分。但這些酶的含量對于基因克隆來說還是太少了，即使是在檢測蛋白最靈敏的銀染蛋白膠上，那個“理應就在那里”的組蛋白乙酰化酶依然杳無蹤跡。
系主任Salih Wakil對他的耐心正逐步消退。
1988年，Grunstein實驗室新鮮出爐的論文終于成了壓垮駱駝的最后一根稻草：盡管Grunstein實際上揭示了組蛋白乙?；瘜τ谵D錄的重要意義，可多數(shù)同行的目光依然停留在了H4組蛋白N端移除的酵母仍然可以健康生長的表型，認為組蛋白乙?；痪哂兄匾纳飳W意義，對于Allis孜孜不倦尋找組蛋白乙?；傅呐︵椭员恰?/span>
因此在終身教職的同行評議中，Allis不幸掛掉了。
貝勒醫(yī)學院已經(jīng)容不下Allis繼續(xù)做他“沒有前途”的乙酰化酶純化研究了，他只得卷鋪蓋走人，投奔到雪城大學（Syracuse University）的門下安身。
失去貝勒醫(yī)學院的職位，并不能擊垮Allis的意志。不成功就成仁，他已經(jīng)下定決心要與組蛋白乙?；杆揽牡降住?/span>
James Brownell的加入成了扭轉乾坤的關鍵。
如何才能讓含量極微的組蛋白乙酰化酶顯露蹤跡呢？
需要放大信號。
之所以他們能在反應中檢測到組蛋白乙酰化酶的生化活性，關鍵還是在于一個組蛋白乙?；改茉趲酌胫畠葘Τ砂偕锨У牡孜镞M行乙?；揎棥?/span>
那在蛋白分離膠上，能否也實現(xiàn)一步信號的放大呢？
來自磷酸化修飾領域研究者的創(chuàng)意給Brownell帶來了靈感：在不久前一項關于磷酸化修飾的研究中，研究者在膠中加入了特定激酶的反應底物，然后在激酶提取物通過電泳被分離開后向其中加入32P同位素標記的ATP分子，如此一來，盡管底物會布滿整張凝膠，但只有在激酶集中的條帶上磷酸化修飾才能發(fā)生，因此在洗掉ATP之后，放射性顯影下呈現(xiàn)出同位素信號的區(qū)域就是激酶集中的位置。[26]
顯影照相記錄的信號來自被磷酸化修飾的底物，但始作俑者卻是激酶。磷酸化修飾和乙?；揎?，本質上都是小的化學基團通過共價鍵連接在蛋白上。
Brownell打算照葫蘆畫瓢，看看能不能通過這種方式在蛋白膠上定位到乙?；浮?/span>
這一次，200升四膜蟲培養(yǎng)液中純化出的蛋白沒有讓他們失望：放射性顯影的照片上，55kDa分子量位置出現(xiàn)了一道清晰的條帶。
四膜蟲的乙酰化酶分子量是55kDa！[27]
有了分子量這個線索，Brownell純化出了更加濃縮的p55蛋白——第一個乙酰化酶的克隆指日可待了！
此時，羅徹斯特大學向Allis拋出了橄欖枝，為他提供了更充足的科研資源。Brownell學籍仍然保留在雪城，人隨導師一起搬到羅徹斯特，而精神上則愈發(fā)接近克隆出乙酰化酶。
終于，第一個乙?；富虻耐暾蛄性贐rownell和Allis面前降臨。有趣的是，基于序列的同源性， Brownell發(fā)現(xiàn)其實研究者此前已經(jīng)克隆出過酵母中p55的同源基因Gcn5。而Gcn5作為轉錄因子對基因表達的激活作用完美印證了Allfrey當年對于組蛋白乙?；δ艿念A測。[28]
Allis克隆乙?；傅恼撐陌l(fā)表一個月后，哈佛大學的化學生物學家Stuart Schreiber循著天然的去乙?；敢种苿┣苟舅?/span>（Trapoxin）留下的線索，克隆出了第一個去乙?；窰D1，發(fā)現(xiàn)其在酵母中的同源基因正是轉錄抑制因子Rpd3。[29]
此時，科學群體中的多數(shù)人才如夢方醒一般，終于意識到組蛋白乙?；揎椀闹匾饬x。
以組蛋白修飾為代表的表觀遺傳學研究爆發(fā)出耀眼的光芒，吸引著那些當初嘲笑過Allis的人們紛紛跟風加入尋寶大隊。
表觀遺傳研究，一躍成了最為熱門的領域。
隨著越來越多的研究者加入表觀遺傳研究的隊伍，人們很快發(fā)現(xiàn)，組蛋白的異常修飾在癌癥發(fā)生過程中扮演著至關重要的作用，靶向組蛋白乙酰化修飾的藥物如今也紛紛已經(jīng)獲批上市造福病人。[30]
Michael Grunstein（左），David Allis（右）
2018年，Grunstein和Allis憑借他們對組蛋白研究開創(chuàng)性的貢獻獲得了拉斯克獎。（另一位應當被銘記的科學家是Alan Wolffe（1959-2001），他在九十年代染色質研究被看作冷門時堅持推進染色質領域的研究，并且努力呼吁人們重視染色質在轉錄調控中的功能。另一位表觀遺傳領域的領軍科學家Danny Reinberg，是在Allis開創(chuàng)出一片表觀遺傳天地之后才一騎當先，從對轉錄因子的癡迷轉向對組蛋白的偏愛，做出了一系列非常精彩的工作，笑傲群雄。）
隨著領域的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)在組蛋白的乙?；浮⑷ヒ阴；覆粌H僅局限于細胞核內。在細胞質基質中，也能觀察到可觀的參與乙酰化修飾分子機器的存在。[31-33]
乙?；诩毎杏袥]有可能是一種非常普遍存在的化學修飾呢？劍橋大學的Tony Kouzarides教授在2000年撰寫的一篇綜述中提出了這樣一個問題。[34]
但組蛋白乙酰化修飾這片已經(jīng)發(fā)掘出的金礦實在太熱門了，急于在其中撈金的多數(shù)人暫時對此無暇顧及。
這時三個轉錄調控領域的門外漢忽然闖了進來，繞開擁擠的人群，從眾人忽視的角落中悄悄取下了最為珍貴的一塊寶石。
這三位昔日曾為同窗，卻又各懷絕技：一位精通信號通路，一位成名于細胞周期調控、不久前剛剛在蛋白降解領域闖出了名堂，而另一位則是專長微生物遺傳學方法的高手。
細胞核外，原來姹紫嫣紅開遍
2004年初，看著學生展示的免疫印跡數(shù)據(jù)，管坤良吃驚地說不出話來。
用靶向乙?；鶊F的抗體與細胞的不同組分進行孵育后，細胞核內檢測到的乙?；揎椥盘柡軓?。這在情理之中，因為細胞核里有組蛋白，組蛋白上有豐富的乙酰化修飾。但在細胞質基質的組分中，乙酰化修飾的信號也不弱。
這就奇怪了，因為正常情況下細胞核內的組蛋白的都不敢越雷池一步。也許信號來自于微管蛋白？——微管蛋白中存在乙?；揎?，但功能一直不清。或許還有可能是其他未知的細胞質基質蛋白存在乙?；揎棧?/span>
這個問題和他目前聚焦的信號通路課題關系不大，因此管坤良沒有過分糾結于這個意外的觀察。但由這張膠圖引發(fā)的問題卻留在了他的腦子里。
兩年的時間過去了，管坤良和同一屆考上CUSEBA項目的老同學熊躍決定攜手回國，兼職在復旦建立一個實驗室為國內培養(yǎng)出更多的科研人才。
兩個人約定，要在新地方爭取開創(chuàng)出一片新領域來，各自美國實驗室正在開展的課題都絕不延伸到復旦MCB實驗室來。
熊躍和管坤良
兩個人頭腦風暴，希望能想出一個能發(fā)揮出各自專長的科學問題。想跳出思維的框架來，可沒那么容易。
就在兩個人思維雙雙陷入停滯之時，兩年前的那張免疫印跡照片忽然間跳入了管坤良的腦海中。
此時，復旦大學剛剛建立了獨立的蛋白質組學質譜平臺，他們心想不如碰碰運氣，看看能不能通過組學的手段找出一兩個發(fā)生乙?；揎椀男掳悬c來吧！
質譜的實驗結果讓兩人吃了一驚。
每一個參與代謝反應的酶上，幾乎都能檢測到乙?；揎椀男盘?。究竟是真正的科學突破，還是檢測方法帶來的假象？
從質譜的數(shù)據(jù)中展現(xiàn)的蛋白清單中，兩人挑了幾個進行檢驗?？磥硇盘柺钦娴?，而且乙?；揎椀挠袩o真的會影響蛋白的活性。
老同學趙國屏聽說了他們的發(fā)現(xiàn)，利用遺傳學工具進行檢驗。敲掉沙門氏菌的乙?；福毦拇x竟會大幅改變?？磥硪阴；揎椀墓δ鼙磺叭舜蟠蟮凸懒?。
整理著數(shù)據(jù)，正準備投稿，忽然發(fā)現(xiàn)一篇新鮮出爐的論文，也把乙?；揎椀膹V泛存在報道。[35,36]難道被慘遭搶發(fā)？不免倒吸一口涼氣。細看同行的數(shù)據(jù)，才算松下一口長氣。他們的論文發(fā)現(xiàn)了更多的靶點，而且做了更充分的驗證。
經(jīng)過半年審稿，總算成功發(fā)表。[37,38] 2010年管坤良、熊躍和趙國屏聯(lián)手發(fā)表的兩篇論文，向人們揭示了細胞中乙?；揎棿嬖诘膹V泛性，為十年以前Tony Kouzarides提出的問題給出了肯定的回答。
乙?；揎椪缌姿峄粯樱羌毎幸环N廣泛存在的共價修飾。在接下來的十年時間里，以復旦腫瘤醫(yī)院雷群英團隊為代表的許多研究，報道了更多乙酰化修飾調節(jié)代謝酶活性和穩(wěn)定性例子，進一步確立了非核蛋白乙?；囊饬x。[39-44]相關研究發(fā)表在Cancer Cell、Molecular Cel、J.Clin.Invest.等雜志上。雷群英也曾多次受冷泉港、美國癌癥年會等國內外的會議邀請作報告，推動了腫瘤代謝學科發(fā)展。
發(fā)現(xiàn)這些新的修飾、新的調節(jié)機制有什么用呢？
我們來舉雷群英團隊發(fā)現(xiàn)的其中一個例子來看看：癌細胞比人體正常的組織細胞更耐酸，并且能通過積累、分泌乳酸來抑制組織細胞的生長。此前人們發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞之所以能產(chǎn)生更多的乳酸，和一個名為乳酸脫氫酶表達量升高密不可分，但對于究竟為什么胰腺癌細胞會產(chǎn)生這么多的乳酸脫氫酶一直都是個謎團。
雷群英團隊在2013年發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶上第五個氨基酸（記作K5）的乙酰化修飾很可能是決定乳酸脫氫酶在細胞內穩(wěn)定性的重要調節(jié)機制——乳酸脫氫酶一旦在K5位置被添加了乙酰基團，就仿佛得到了一張“免死金牌”，變得不那么容易被細胞降解掉了，因此乳酸脫氫酶K5位點的乙?；揎椨锌赡苁且认侔┘毎缙诎┳冞^程中的一個主要特點。[39]
如果我們能在體檢的過程中檢查乳酸脫氫酶K5位點的乙?；揎?，是否可能在胰腺癌發(fā)生癌變的早期提前“感知到”潛在的危險，進而通過預防和治療避免病情的惡化呢？這便是這一發(fā)現(xiàn)潛在的臨床轉化價值。
為什么早期乙?；难芯空邥⒕性诮M蛋白中，而沒能發(fā)現(xiàn)乙?；揎椄鼮閺V泛的存在呢？檢測手段有局限。Allfrey在60年代研究乙?；揎棔r，手中并沒有能靶向乙酰集團的抗體——他需要依靠整合進組蛋白的同位素來推測組蛋白是否發(fā)生了乙?；揎?；此外，也離不開管坤良勤于思考：也許在他之前也有人觀察到了細胞質基質中的乙?；揎椥盘枺珱]有深究，于是錯失了打開一片新領域的機會。
熊躍和管坤良能在很短時間內揭示這一重要現(xiàn)象，另一個不容忽視的因素就是質譜技術的發(fā)展：得力于物理學和化學的發(fā)展，如今的質譜儀器能做到“明察秋毫”，也由此揭示出細胞中許多前人未曾發(fā)現(xiàn)的新發(fā)現(xiàn)。
參考文獻：
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