光遺傳學(xué)背后的科學(xué)家們
視紫紅質(zhì)的發(fā)現(xiàn)
光可被細(xì)菌、藻類等低等生命和人類等高等動(dòng)物通過視紫紅質(zhì)系統(tǒng)而感知。20世紀(jì)70年代后，幾種細(xì)菌和藻類通道視紫紅質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為光控系統(tǒng)的誕生奠定了基礎(chǔ)。光遺傳學(xué)最初由米森伯克于2002年首次實(shí)現(xiàn)并于2005年由迪塞羅斯（也譯作代塞爾羅斯）和博伊登進(jìn)一步完善，其應(yīng)用極大地增強(qiáng)了對(duì)大腦功能的理解。
光遺傳學(xué)可使科學(xué)家借助光來精確開閉特異神經(jīng)元從而達(dá)到操縱神經(jīng)元活性和動(dòng)物行為的目的。光遺傳學(xué)技術(shù)已被證明是在細(xì)胞和系統(tǒng)層面研究健康和病理大腦活性的一個(gè)非常強(qiáng)大且有用的工具。文章系統(tǒng)介紹了光遺傳學(xué)誕生的歷史背景、重大事件、發(fā)展過程、應(yīng)用領(lǐng)域及重要價(jià)值等。
光對(duì)生命具有舉足輕重的地位，“萬物生長(zhǎng)靠太陽(yáng)”。對(duì)大部分植物而言，它們借助光合作用合成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并釋放出氧氣，而動(dòng)物則依靠這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧來維持生存。此外，光還可以指導(dǎo)細(xì)菌和植物的向光性，控制植物生長(zhǎng)和開花時(shí)間。
對(duì)于人類和其他動(dòng)物而言，借助光來觀察和感知這個(gè) “光明” 世界。該過程由 “眼睛” 完成，稱為視覺。大部分視覺健康的人都可通過眼睛清晰地觀察到這個(gè)世界，看到周圍的花花草草和五光十色的世界。那么，我們是如何觀察到這些事物的呢？文藝復(fù)興后，人們對(duì)光的本質(zhì)進(jìn)行探索，從而對(duì)光的成像機(jī)制有了新認(rèn)識(shí)，自然對(duì)視覺形成機(jī)制也產(chǎn)生濃厚興趣。
視紫紅質(zhì)
視覺研究可追溯到18世紀(jì)。荷蘭科學(xué)家列文虎克（Antonie Philips van Leeuwenhoek）借助顯微鏡觀察眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，鑒定出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）、視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞等，并推測(cè)這些細(xì)胞與視覺形成相關(guān)。1851年，德國(guó)解剖學(xué)和生理學(xué)家繆勒（Heinrich Müller，1820—1864）首次報(bào)道視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞顯紅色這一現(xiàn)象 [1]。遺憾的是，繆勒錯(cuò)誤地認(rèn)為紅色由血液造成。盡管如此，繆勒仍被看作視覺生理研究的先驅(qū)?？娎赵谝曈X生物學(xué)領(lǐng)域作出諸多貢獻(xiàn)，如首次描述視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這類細(xì)胞也因此獲名“繆勒細(xì)胞”。
博爾（Franz Boll，1849—1879）是一位德國(guó)生理學(xué)家，對(duì)視覺形成具有濃厚興趣。1876年11月，博爾也觀察到紅色視桿細(xì)胞，并認(rèn)定紅色源于其含有一類特殊物質(zhì)，糾正了繆勒早期的錯(cuò)誤。博爾還發(fā)現(xiàn)視桿細(xì)胞的紅色受光影響，光照可導(dǎo)致紅色褪去，而在暗處又重新恢復(fù)，進(jìn)一步說明紅色物質(zhì)與視覺形成相關(guān)。遺憾的是，博爾的早逝（年僅30歲）使研究沒有進(jìn)一步開展。
1877年1月，博爾的同胞、另一位德國(guó)著名生理學(xué)家屈內(nèi)（Wilhelm Friedrich Kühne，1837—1900）進(jìn)一步糾正博爾的不足，認(rèn)定視網(wǎng)膜感光物質(zhì)應(yīng)為紫紅色，并創(chuàng)造 “視紫紅質(zhì)（rhodopsin）” 一詞。屈內(nèi)還取得另一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，即膽酸可使視桿細(xì)胞內(nèi)的視紫紅質(zhì)釋放到溶液里，并基于這一原理首次從牛視網(wǎng)膜完成視紫紅質(zhì)的純化 [2]，屈內(nèi)也因此成為視覺生理領(lǐng)域的奠基人之一（圖1）。雖然已確定視紫紅質(zhì)參與視覺形成，但具體分子機(jī)制仍不清晰，直到20世紀(jì)30年代才有突破。
視黃醛循環(huán)
1931 年， 美國(guó)眼科專家尤德金（Arthur Yudkin，1892—1957）開始對(duì)視網(wǎng)膜成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有一種維生素A樣物質(zhì)。其實(shí)，人們很早就知道維生素A缺乏可影響視覺形成，最常見的一種疾病叫夜盲癥，但對(duì)維生素A如何參與視覺卻知之甚少。
1932 年， 美國(guó)生理學(xué)家瓦爾德（George Wald， 1906—1997）來到德國(guó)瓦伯格（Otto Heinrich Warburg，1931年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）實(shí)驗(yàn)室開始全面研究視紫紅質(zhì)。瓦爾德首先借助光譜分析法證明青蛙、綿羊、牛等完整視網(wǎng)膜中存在維生素A，接著使用氯仿提純視紫紅質(zhì)，化學(xué)顯色反應(yīng)表明所含物質(zhì)與維生素A非常相似。
為進(jìn)一步證實(shí)結(jié)論，瓦爾德加入瑞士著名科學(xué)家卡雷爾（Paul Karrer，1937年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者）的實(shí)驗(yàn)室，而卡雷爾分離并確定了維生素A的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過3個(gè)月研究，瓦爾德最終確定視紫紅質(zhì)中確實(shí)含有維生素A，從而表明視紫紅質(zhì)包含兩部分：視蛋白（opsin）和維生素A [3]。隨后，瓦爾德又加入德國(guó)海德堡邁耶霍夫（Otto Fritz Meyerhof，1922年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)開展視覺形成研究。
一次偶然事件為研究帶來重大契機(jī)！當(dāng)時(shí)正逢假期，許多實(shí)驗(yàn)室人員都去度假，恰在此時(shí)運(yùn)抵300只青蛙。實(shí)驗(yàn)室助理原本想丟棄，而瓦爾德則主動(dòng)要求留下來用作實(shí)驗(yàn)材料。瓦爾德從青蛙視網(wǎng)膜提取到足夠量的視紫紅質(zhì)，進(jìn)一步分析后驚奇地發(fā)現(xiàn)所含的維生素A與卡雷爾所得維生素A盡管大部分性質(zhì)相似，但仍有些許差異，因此將這種物質(zhì)重新命名為視網(wǎng)膜色素（retinene）。瓦爾德還發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素與維生素A之間可發(fā)生轉(zhuǎn)變，并通過后來詳細(xì)的結(jié)構(gòu)分析確定了兩者間的差異，因此視網(wǎng)膜色素更名為視黃醛，而維生素A則稱為視黃醇 [4]。
20世紀(jì)50年代，瓦爾德和同事經(jīng)過近20年探索，最終解析出視覺形成的 “視黃醛循環(huán)” 機(jī)制：靜息狀態(tài)下，視桿細(xì)胞內(nèi)視蛋白與11-順視黃醛結(jié)合形成視紫紅質(zhì)；光線照射可使11-順視黃醛發(fā)生異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)槿词揭朁S醛，從而與視蛋白分離，這個(gè)過程激活視蛋白，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終到達(dá)大腦視覺中心；全反式視黃醛可被運(yùn)輸?shù)揭暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過幾步化學(xué)反應(yīng)重新生成11-順視黃醛；11-順視黃醛回到視桿細(xì)胞再次與視蛋白結(jié)合形成視紫紅質(zhì)，從而完成一次視覺感知過程（圖2）。瓦爾德的發(fā)現(xiàn)很好地詮釋了視黃醛參與視覺形成的機(jī)制，因此他分享了1967年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
后續(xù)研究還揭示了視蛋白作用機(jī)制。視蛋白是一種G-蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）。光通過改變視黃醛結(jié)構(gòu)而激活視蛋白后，可進(jìn)一步使異三聚體G蛋白激活，從而使磷酸二脂酶活化，催化cGMP水解為5’-GMP而減少cGMP含量；細(xì)胞內(nèi)受cGMP調(diào)控的離子通道關(guān)閉，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位出現(xiàn)變化，最終傳導(dǎo)至視覺中心而實(shí)現(xiàn)光的感知。
從這個(gè)過程可以看出，哺乳動(dòng)物視紫紅質(zhì)的作用機(jī)制較為復(fù)雜，作為機(jī)體視覺感知過程尚可接受，如果將它們應(yīng)用到其他系統(tǒng)則困難重重，因此有必要尋找更簡(jiǎn)單的感光系統(tǒng) [5]。
細(xì)菌感光
最初認(rèn)為只有高等動(dòng)物才存在視覺系統(tǒng)，但這一觀念在20世紀(jì)60年代發(fā)生改變。1967年，德裔美國(guó)生理學(xué)家斯托克尼烏斯（Walther Stoeckenius，1921—2013）成為加州大學(xué)舊金山分校的教授，重點(diǎn)研究生物膜（如紅細(xì)胞膜和線粒體膜）結(jié)構(gòu) [5]。由于生物膜材料獲取比較困難，具有電子顯微鏡背景的斯托克尼烏斯決定用生物化學(xué)方法研究鹽生鹽桿菌（Halobacterium halobium）細(xì)胞膜組成。隨后兩位新同事的到來壯大了實(shí)驗(yàn)室的力量。
厄斯特黑爾特（Dieter Oesterhelt，也譯作奧斯特黑爾特）是一位訓(xùn)練有素的德國(guó)化學(xué)家，跟隨呂南（Feodor Lynen，1964年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）獲得博士學(xué)位，由于學(xué)術(shù)休假的緣故來到美國(guó)；布勞羅克（Allen Blaurock）是一位剛畢業(yè)的英國(guó)生物物理學(xué)家，原來在國(guó)王學(xué)院威爾金斯（Maurice Wilkin，1962年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）實(shí)驗(yàn)室從事X射線衍射研究 [6]。
厄斯特黑爾特和布勞羅克借助X射線衍射技術(shù)觀測(cè)細(xì)菌細(xì)胞膜紫色組分時(shí)，意外觀察到一種清晰的衍射圖像，說明其含有一種高度有序的生物分子。厄斯特黑爾特還觀察到紫色物質(zhì)在添加有機(jī)溶劑后顏色變黃。此時(shí)，布勞羅克回憶起在國(guó)王學(xué)院研究青蛙視網(wǎng)膜過程中也觀察到類似的顏色變化，這一提示促使厄斯特黑爾特大膽假設(shè)該物質(zhì)可能也是視紫紅質(zhì)。為證實(shí)這一假說，首先需解答的問題是其含不含視黃醛。
從細(xì)菌中尋找視黃醛這一近乎瘋狂的想法促使厄斯特黑爾特立即啟動(dòng)驗(yàn)證工作。借鑒青蛙視紫紅質(zhì)的研究方法，厄斯特黑爾特發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的紫色物質(zhì)具有類似的物理和化學(xué)性質(zhì)，并且還含有視黃醛?；谶@些特性，厄斯特黑爾特和斯托克尼烏斯于1971年確定這是一種新型視紫紅質(zhì)，根據(jù)來源將其命名為細(xì)菌視紫紅質(zhì)（bacteriorhodopsin，BR）（圖3）[7]。
斯托克尼烏斯經(jīng)過進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌視紫紅質(zhì)是一種光依賴的離子通道。更大的突破在1975年，英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的亨德森（Richard Henderson，2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者）解析了細(xì)菌視紫紅質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，從而對(duì)視紫紅質(zhì)的作用有了更深入的認(rèn)識(shí)。
1972年，重組DNA技術(shù)的發(fā)明為生命科學(xué)帶來一場(chǎng)革命，同時(shí)也積極推動(dòng)了細(xì)菌視紫紅質(zhì)研究的發(fā)展。研究人員將細(xì)菌視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光照可引起氫離子外流，從而證明其為一種光控的氫離子通道。1977年，研究人員在細(xì)菌中又發(fā)現(xiàn)另一種視紫紅質(zhì)——鹵視紫紅質(zhì)（halorhodopsin），后續(xù)證明其介導(dǎo)氯離子細(xì)胞內(nèi)流 [8]。
一系列的研究表明，即使簡(jiǎn)單如細(xì)菌這樣的單細(xì)胞生物也存在 “視覺系統(tǒng)”，標(biāo)志著一個(gè)新領(lǐng)域——低等生物視紫紅質(zhì)的誕生，從而促使科學(xué)家去尋找其他視紫紅質(zhì)。
藻類趨光
班貝格（Ernst Bamberg）是一位德國(guó)生物物理學(xué)家，從20世紀(jì)70年代開始研究細(xì)菌視紫紅質(zhì)的生物學(xué)功能，并利用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BR是一種光激活氫離子通道。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和完善，生命科學(xué)的研究模式發(fā)生根本性改變，膜蛋白研究不再需要繁瑣困難的提取過程，只需將外源基因在特定宿主細(xì)胞表達(dá)即可。
90年代，已加入德國(guó)法蘭克福馬普研究所的班貝格與從美國(guó)回來不久的德國(guó)電生理學(xué)家納格爾（Georg Nagel）決定合作，共同研究細(xì)菌視紫紅質(zhì)在完整細(xì)胞中的生物功能。1995年，他們合作將細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因成功轉(zhuǎn)入非洲爪蟾卵母細(xì)胞，進(jìn)一步精確證實(shí)光激活質(zhì)子泵的電壓依賴性 [9]。2001年，他們進(jìn)一步在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中證實(shí)鹵視紫紅質(zhì)是一種氯離子通道（圖4）。班貝格與納格爾的合作一方面建立了視紫紅質(zhì)功能研究平臺(tái)，另一方面也初顯光遺傳學(xué)雛形，即將外源視紫紅質(zhì)在靶細(xì)胞表達(dá)。
19世紀(jì)，綠藻（Chlamydomonas）等藻類就被發(fā)現(xiàn)具有向光性和受光調(diào)控的特性，但對(duì)這些現(xiàn)象背后的原因知之甚少。直到20世紀(jì)80年代，大量事實(shí)表明藻類也長(zhǎng) “眼睛”，即細(xì)胞膜存在感光物質(zhì)，稱為 “光受體”。
80年代初，德國(guó)生物物理學(xué)家赫格曼（Peter Hegemann）在博士就讀期間就決定研究光受體。赫格曼和學(xué)生以萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）為材料，借助電生理實(shí)驗(yàn)表明光的確可誘導(dǎo)藻類細(xì)胞產(chǎn)生電流 [10]。赫格曼決定采用生物化學(xué)方法將光受體蛋白純化后研究其性質(zhì)。遺憾的是，十余年辛苦努力最終以失敗告終。根本原因在于光受體是一種膜蛋白，含量低、穩(wěn)定性差且異質(zhì)性高，這些都是蛋白質(zhì)純化的大忌。赫格曼不得不轉(zhuǎn)換研究思路來解決這個(gè)難題。
2001年，綠藻基因組測(cè)序的完成為問題的解決帶來轉(zhuǎn)機(jī)。赫格曼通過全面搜索和比對(duì)綠藻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，從中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)候選基因與細(xì)菌視紫紅質(zhì)具有較高同源性。
為加快研究進(jìn)程，赫格曼決定尋求合作。他在獲悉納格爾的研究工作后，積極溝通并與其達(dá)成合作協(xié)議。赫格曼小組負(fù)責(zé)克隆兩種綠藻視紫紅質(zhì)候選基因，并將其送給納格爾開展功能研究；納格爾則將基因轉(zhuǎn)入人腎胚細(xì)胞HEK293并實(shí)現(xiàn)正確表達(dá)。功能研究表明，它們的活性均受光調(diào)控，并且介導(dǎo)陽(yáng)離子如鈉離子、鈣離子等的攝入（圖4），因此將其分別命名為通道視紫紅質(zhì)（channelrhodpsin，ChR）1和2 [11-12]。與ChR1相比，ChR2光激活時(shí)間更短，且離子通透性更強(qiáng)，因此更適合于研究。更為重要的是，赫格曼還推測(cè)這些通道視紫紅質(zhì)不僅可在普通細(xì)胞表達(dá)，而且也可在神經(jīng)元中表達(dá)并影響電生理活性。這一論斷直接催生了光遺傳學(xué)。
至此，研究人員已經(jīng)鑒定出三類光控視紫紅質(zhì)，分別是細(xì)菌視紫紅質(zhì)（介導(dǎo)氫離子輸出）、通道視紫紅質(zhì)（介導(dǎo)陽(yáng)離子輸入）和鹵視紫紅質(zhì)（介導(dǎo)氯離子輸入）。它們?cè)谏窠?jīng)功能研究方面具有何種應(yīng)用價(jià)值呢？這要從神經(jīng)興奮說起。
神經(jīng)興奮
大腦是神經(jīng)系統(tǒng)的中樞，是機(jī)體最復(fù)雜和最神秘的器官。知覺、運(yùn)動(dòng)、興奮、情感、語(yǔ)言、學(xué)習(xí)和記憶等過程基本都在大腦特異區(qū)域完成。大腦由上百億神經(jīng)元（亦稱神經(jīng)細(xì)胞）構(gòu)成，這些神經(jīng)元之間通過特定方式實(shí)現(xiàn)彼此間交流，以達(dá)到協(xié)調(diào)控制機(jī)體各種行為的目的。神經(jīng)元活性受電信號(hào)影響。
正常情況下，神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)陰陽(yáng)離子分布不均勻（這種現(xiàn)象稱為極性）：膜內(nèi)鉀離子濃度遠(yuǎn)高于膜外，膜外鈉離子濃度又遠(yuǎn)高于膜內(nèi)，最終形成一個(gè)外正內(nèi)負(fù)的狀態(tài)。未受刺激時(shí)（靜息狀態(tài)），規(guī)定膜外電位為0，則哺乳動(dòng)物神經(jīng)元膜內(nèi)電位為負(fù)值，約-70mV，稱為靜息電位；外界刺激可導(dǎo)致離子通道打開，由于離子移動(dòng)而引起膜兩側(cè)離子濃度發(fā)生變化，電位差也隨之改變。如果-70mV向0方向改變，則稱去極化（電位為0意味著內(nèi)外無離子濃度差距，極化消失）；相反，-70mV向更大負(fù)值變化則稱超極化（意味著離子分布不均勻加?。?/span>。
一般而言，去極化伴隨神經(jīng)元激活，而超極化則意味著神經(jīng)元抑制，因此通過改變神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)外離子分布可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制神經(jīng)元活性的目的。
1979年，美國(guó)索爾克研究所著名科學(xué)家、DNA雙螺旋提出者之一克里克（Francis Crick，1962年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）在《科學(xué)美國(guó)人》發(fā)表一篇文章 [13]，對(duì)腦科學(xué)未來的發(fā)展進(jìn)行展望。古典神經(jīng)生物學(xué)家通常采用電極刺激大腦特定區(qū)域神經(jīng)元的方式來影響行為，克里克認(rèn)為這種方法破壞性大且精確性不高，比如無法準(zhǔn)確區(qū)分不同的神經(jīng)元，這些因素導(dǎo)致所得結(jié)果準(zhǔn)確性差。
為此，克里克提出應(yīng)開發(fā)一種精確控制神經(jīng)元活性的方法，允許研究根據(jù)需要只對(duì)特定神經(jīng)元打開或關(guān)閉，同時(shí)不影響非相關(guān)神經(jīng)元。具有分子生物學(xué)背景的克里克進(jìn)一步指出可以對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，從而使它們可對(duì)外界信號(hào)（如光刺激）產(chǎn)生精準(zhǔn)性應(yīng)答。這一理念建立了光遺傳學(xué)的思想雛形。
盡管光控細(xì)胞行為的理念已經(jīng)提出，但真正實(shí)現(xiàn)則需要有可行的工具。2002年，這一想法終于首次變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
神經(jīng)光控
米森伯克（Gero Andreas Miesenb?ck）是一位奧地利神經(jīng)科學(xué)家，跟隨魯斯曼（James Edward Rothman，2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）開展博士后研究。他主要借助熒光系統(tǒng)來檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)囊泡運(yùn)輸，因而對(duì)光產(chǎn)生濃厚興趣。
1999年，米森伯克建立自己的實(shí)驗(yàn)室，開始獨(dú)立的科研生涯，目光鎖定神經(jīng)生物學(xué)。米森伯克對(duì)整個(gè)神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域一知半解，可以說有點(diǎn) “門外漢” 的味道，但是恰恰這個(gè)因素反而使他在光遺傳學(xué)方面首先完成突破，因?yàn)樗粫?huì)受主流觀點(diǎn)所羈絆。生命科學(xué)研究的基本策略在于首先控制某種因素（干預(yù)），然后依據(jù)結(jié)果確定因果關(guān)系，如敲除特定基因后動(dòng)物出現(xiàn)某種表型異常（如個(gè)子變矮），據(jù)此可認(rèn)為該基因參與了某個(gè)過程（如肢體發(fā)育）。
然而，由于神經(jīng)系統(tǒng)自身的復(fù)雜性，長(zhǎng)期以來神經(jīng)生物學(xué)家主要依賴形態(tài)觀察，而缺乏更多有效的干預(yù)手段。米森伯克想改變這一現(xiàn)狀，他完全從一個(gè)生物學(xué)家的視點(diǎn)來看待這個(gè)問題，因此想為神經(jīng)元安裝一套感光系統(tǒng)（遺傳學(xué)操作），然后借助光照（光學(xué)）來達(dá)到控制神經(jīng)元的目的 [14]。為盡快實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，米森伯克邀請(qǐng)魯斯曼的另一位學(xué)生、自己的師弟澤梅爾曼（Boris Valery Zemelman）加入團(tuán)隊(duì)，啟動(dòng)光控神經(jīng)元活性的研究計(jì)劃（圖5）。
當(dāng)時(shí)可用的感光系統(tǒng)主要是動(dòng)物視紫紅質(zhì)，而哺乳動(dòng)物過于復(fù)雜的光轉(zhuǎn)導(dǎo)過程自然使米森伯克望而卻步，不得不尋找其他替代品。幸運(yùn)的是，他們?cè)诠壷姓业揭粋€(gè)簡(jiǎn)單系統(tǒng)，該系統(tǒng)只需三種蛋白參與，分別為視紫紅質(zhì)抑制蛋白-2（arrestin-2）、視紫紅質(zhì)（rhodopsin）和G蛋白a亞基（G protein alpha subunit）。他們?yōu)樵撓到y(tǒng)杜撰一個(gè)名稱 “chARGe”，之所以這樣命名，原因在于 “charge” 還有另一層含義 “電荷”，說明該系統(tǒng)目的在于通過影響離子（帶電荷的原子或原子團(tuán)）運(yùn)動(dòng)而改變動(dòng)作電位。
整個(gè)實(shí)驗(yàn)主要有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：首先將三種基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的海馬神經(jīng)元；其次測(cè)試光照轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元后動(dòng)作電位的變化情況。2002年初，米森伯克小組首次在體外證明光照可控神經(jīng)元的活性 [15]，從而開啟神經(jīng)生物學(xué)研究的新篇章。
然而，果蠅chARGe系統(tǒng)在應(yīng)用中存在諸多缺陷。首先需要三種蛋白，因此無論從轉(zhuǎn)基因效率還是三者協(xié)調(diào)能力都將大打折扣；其次盡管可產(chǎn)生動(dòng)作電位，但時(shí)間長(zhǎng)、幅度小，不易觀察和操作；最后，實(shí)驗(yàn)體系不穩(wěn)定，產(chǎn)生的動(dòng)作電位無規(guī)律，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，從而也就意味著難以真正實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控。
為解決這些不足，米森伯克小組對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。他們選擇哺乳動(dòng)物離子通道如P2X2和TRPV1等替代chARGe系統(tǒng)，這些通道蛋白都是單組分，因此大大降低實(shí)驗(yàn)難度，增加精準(zhǔn)度。然而，這些通道蛋白活性本身并不受光調(diào)控，而是與配體如ATP和capsaicin等結(jié)合相關(guān)。米森伯克借鑒博士后工作期間的靈感，成功設(shè)計(jì)出光照影響二者結(jié)合的實(shí)驗(yàn)體系，從而達(dá)到光控神經(jīng)元活性的目的 [16]。
但是，該系統(tǒng)也存在一些缺陷，如穩(wěn)定性差（間接作用引起）等，還有一大不足在于這些離子通道都是哺乳動(dòng)物蛋白，因此外源基因和自身基因之間存在互相干擾，這種現(xiàn)象稱為系統(tǒng)不正交，從而為精準(zhǔn)調(diào)控帶來巨大難題。
2004年，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分?？死?/span>（Richard Kramer）小組進(jìn)一步對(duì)鉀離子通道實(shí)現(xiàn)改造，最終也達(dá)到光控哺乳動(dòng)物神經(jīng)元活性的目的 [16]。然而，這些改進(jìn)整體而言效果有限，因此迫切需要成分少、速度快、強(qiáng)度高、正交好的光控系統(tǒng)。藻類通道視紫紅質(zhì)恰好滿足所有這些要求，因此，2002和2003年先后發(fā)表的藻類ChR文章立刻吸引了眾多科學(xué)家的目光，激發(fā)他們快速加入該領(lǐng)域。
光遺傳學(xué)
迪塞羅斯（Karl Alexander Deisseroth）是一位美國(guó)精神病學(xué)家和神經(jīng)科學(xué)家，1998年獲得斯坦福大學(xué)神經(jīng)科學(xué)博士學(xué)位，主要研究神經(jīng)元突觸活動(dòng)影響細(xì)胞基因表達(dá)的機(jī)制，而該研究對(duì)理解大腦的記憶功能具有十分重要的意義。
博士畢業(yè)后，迪塞羅斯最初想成為一名神經(jīng)外科醫(yī)生，因此在斯坦福醫(yī)學(xué)院完成實(shí)習(xí)和精神科住院醫(yī)師培訓(xùn)。然而，當(dāng)他在精神分裂癥患者治療過程中體會(huì)到明顯的無力感后，毅然決然改變選擇，轉(zhuǎn)向探索大腦的工作機(jī)制，以洞悉嚴(yán)重抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥等的發(fā)病過程，以期找到治療良策。
隨后，迪塞羅斯進(jìn)入著名神經(jīng)生物學(xué)家錢永佑（Richard Tsien）實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)博士后工作，并在這里結(jié)識(shí)了畢業(yè)于麻省理工學(xué)院擁有物理和電氣工程背景的博伊登（Edward S. Boyden）。由于志趣相投，他們很快就成為科研摯友，并決定聯(lián)合開發(fā)一種精準(zhǔn)控制神經(jīng)元行為的工具（圖6）。他們最初設(shè)想采用磁控策略，未獲成功。稍后博伊登將目光轉(zhuǎn)向光控，對(duì)視紫紅質(zhì)產(chǎn)生濃厚興趣，并獲得細(xì)菌鹵視紫紅質(zhì)質(zhì)粒。
遺憾的是，因其他事宜這一計(jì)劃未能實(shí)施。后來博伊登被米森伯克2002年發(fā)表的文章所深深觸動(dòng)，決定重拾光控神經(jīng)元的研究計(jì)劃。不久他又讀到赫格曼發(fā)表的ChR2文章，很快就構(gòu)思出一個(gè)完美的研究計(jì)劃。
2004年2月，博伊登建議迪塞羅斯從納格爾那里借ChR2質(zhì)粒。3月，迪塞羅斯與納格爾達(dá)成合作協(xié)議，獲得ChR2質(zhì)粒使用權(quán)。質(zhì)粒到達(dá)后，兩人立即著手實(shí)驗(yàn)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒θ匀粵]有把握。
首先，ChR2在神經(jīng)元能否高表達(dá)？其次，神經(jīng)元是否也不需要視黃醛輔助？需要的話將無形增加系統(tǒng)復(fù)雜性。第三，外源ChR2能否產(chǎn)生足夠電流而引發(fā)動(dòng)作電位？最后，即使一切都順利，會(huì)不會(huì)被其他實(shí)驗(yàn)室搶先發(fā)表？因?yàn)樵S多研究人員已經(jīng)意識(shí)到光控的可行性。盡管有這些考量，但當(dāng)務(wù)之急則是加快研究進(jìn)程。
迪塞羅斯通過優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染程序而使ChR2在海馬神經(jīng)元完美表達(dá)且正確定位于細(xì)胞膜，從而解除第一個(gè)擔(dān)心；博伊登檢測(cè)到表達(dá)外源ChR2的神經(jīng)元電在不添加視黃醛的前提下，藍(lán)光照射可在50 ms內(nèi)引起足夠陽(yáng)離子流入，產(chǎn)生明顯去極化效應(yīng)。2015年1月，斯坦福大學(xué)本科生張峰（Feng Zhang）加入迪塞羅斯實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)一步構(gòu)建出包含ChR2的病毒載體，大大增加了轉(zhuǎn)染效率，電生理實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步證實(shí)其高效的光控活性 [17]。
為取得發(fā)現(xiàn)優(yōu)先權(quán)，他們于2005年4月19日迅速將論文提交到美國(guó)《科學(xué)》雜志，卻被以 “沒有在神經(jīng)元中取得關(guān)于ChR2功能新發(fā)現(xiàn)” 的理由拒稿。5月5日，他們將文章轉(zhuǎn)投英國(guó)《自然》雜志，也同樣被拒稿。但幸運(yùn)的是，稿件隨后被轉(zhuǎn)到《自然-神經(jīng)科學(xué)》雜志，并最終被接收，于2005年8月在線發(fā)表 [18]。這篇文章也被看作光遺傳學(xué)領(lǐng)域真正意義上的開山之作。
隨后幾個(gè)月，多家實(shí)驗(yàn)室先后發(fā)表文章證實(shí)光控神經(jīng)元活性的可行性。由于天然ChR2在實(shí)際應(yīng)用中仍存在諸多不足，研究人員在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行改造。他們通過采取點(diǎn)突變的策略制備得到一系列新型ChR2變體，極大地豐富了光遺傳學(xué)工具箱。2006年初，迪塞羅斯首次提出光遺傳學(xué)一詞 [19]，用以描述聯(lián)合光學(xué)和遺傳學(xué)操作實(shí)現(xiàn)對(duì)特定神經(jīng)元活性（或動(dòng)物行為）精準(zhǔn)控制的技術(shù)。
行為光控
體外光控神經(jīng)元活性僅影響動(dòng)作電位，而更大的挑戰(zhàn)在于能否通過影響體內(nèi)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢贿M(jìn)而控制生物行為。該領(lǐng)域的首個(gè)突破來自米森伯克實(shí)驗(yàn)室。已知果蠅存在逃跑反應(yīng)，當(dāng)它們感知周圍存在威脅時(shí)會(huì)觸發(fā)大腦特定神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢蛔兓?，進(jìn)一步影響其他神經(jīng)元活性并實(shí)施逃跑行為——飛走。
米森伯克的學(xué)生利馬（Susana Lima）將光控蛋白基因轉(zhuǎn)入特定神經(jīng)元，隨后的光照就會(huì)造成果蠅逃跑反應(yīng)啟動(dòng)。然而，該實(shí)驗(yàn)體系存在一個(gè)明顯的漏洞——果蠅本身對(duì)光線也非常敏感，單純光照也可引起正常果蠅逃離。為區(qū)分果蠅的逃跑行為源于直接光控還是視覺感知引起的間接效應(yīng)，米森伯克小組進(jìn)一步將轉(zhuǎn)基因果蠅頭部去除以消除它們的視覺系統(tǒng)（果蠅仍可存活一定時(shí)間）。這些無頭果蠅胸部仍保留神經(jīng)元，光照后它們?nèi)匀怀尸F(xiàn)逃跑反應(yīng) [20]，因而證實(shí)光確實(shí)直接控制神經(jīng)元活性。
相對(duì)于低等動(dòng)物果蠅，小鼠的精準(zhǔn)行為光控就困難重重。首先，他們需要保證視蛋白只在特定神經(jīng)元如參與睡眠、記憶或焦慮等表達(dá)。為此，他們分離得到神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子序列，將其連接到ChR2基因上游，從而保證ChR2只在這類神經(jīng)元表達(dá)。其次，需要解決光照到達(dá)的問題。為此他們?cè)O(shè)計(jì)了一套設(shè)備，有效解決了這一難題。
2005年，迪塞羅斯小組開始嘗試光控動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)。他們首先成功制備下丘腦睡眠相關(guān)神經(jīng)元特異啟動(dòng)子的ChR2轉(zhuǎn)基因小鼠，然后將該小鼠放置于黑暗房間并處于睡眠狀態(tài)，進(jìn)一步藍(lán)光刺激可喚醒小鼠，而正常小鼠則沒有這種應(yīng)答 [21]。隨后，多個(gè)研究小組證實(shí)在動(dòng)物水平上可實(shí)現(xiàn)光照控制行為的目的（圖7）。
重大應(yīng)用
光遺傳學(xué)通過融合光學(xué)和遺傳學(xué)的操作技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦特定神經(jīng)元的精準(zhǔn)時(shí)空控制。時(shí)間方面，控制精度可達(dá)毫秒量級(jí)；而空間方面，則可針對(duì)單一類型細(xì)胞。這一優(yōu)勢(shì)使光遺傳學(xué)在探索大腦行為機(jī)制和部分疾病治療方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。今天，全世界有上千家實(shí)驗(yàn)室在使用光遺傳學(xué)技術(shù)研究大腦行為及其他科學(xué)問題。
在基礎(chǔ)研究方面，神經(jīng)生物學(xué)家借助光遺傳學(xué)對(duì)許多大腦功能，如學(xué)習(xí)、記憶、新陳代謝、饑餓、睡眠、獎(jiǎng)勵(lì)、動(dòng)機(jī)、恐懼、嗅覺和觸覺等過程有了更為清晰的理解和認(rèn)識(shí) [22]，并且揭示眾多新機(jī)制，如個(gè)體特定狀態(tài)下（如焦慮、風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避等）大腦回路復(fù)雜行為的產(chǎn)生過程。
光遺傳學(xué)技術(shù)還揭示帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的新機(jī)制，從而為藥物研發(fā)提供重要靶點(diǎn)，同時(shí)也為新藥篩選和測(cè)試提供重要技術(shù)平臺(tái) [23]。臨床應(yīng)用方面，光遺傳學(xué)有望在失明等疾病治療方面發(fā)揮重要作用。
未來幾年，隨著光遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善，其價(jià)值將得到進(jìn)一步體現(xiàn)，有望從根本上提升對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)以及非神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)生理和病理過程的理解和認(rèn)識(shí)，為部分疾病的治療帶來新突破。最近，光遺傳學(xué)還在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中開展相關(guān)研究，從而給未來臨床應(yīng)用帶來更大期望。當(dāng)然，光遺傳學(xué)本身涉及轉(zhuǎn)基因過程，因此安全性和有效性問題尚待進(jìn)一步評(píng)估。
光遺傳學(xué)在幾年內(nèi)已經(jīng)發(fā)展成為一種最先進(jìn)的技術(shù)，并給神經(jīng)生物學(xué)帶來一場(chǎng)革命 [24]。2010年，光遺傳學(xué)被《自然-方法學(xué)》評(píng)為 “年度方法”，還被《科學(xué)》雜志評(píng)為十年重大突破 [25-26]。這項(xiàng)技術(shù)突破使我們能夠解決以前無法想象的生物學(xué)問題。
光遺傳學(xué)被認(rèn)為是自20世紀(jì)50年代以來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域最重大的進(jìn)展之一，可與腦電極使用、功能性磁共振成像相媲美。光遺傳學(xué)還直接推動(dòng)2013年美國(guó)啟動(dòng)腦科學(xué)計(jì)劃，大約耗資3億美元，旨在開發(fā)治療阿爾茨海默病、自閉癥、精神分裂癥和創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)疾病的藥物或技術(shù)。
光遺傳學(xué)的成就已得到學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可。許多作出卓越貢獻(xiàn)的科學(xué)家，如厄斯特黑爾特、班貝格、納格爾、赫格曼、米森伯克、澤梅爾曼、迪塞羅斯和博伊登等都先后獲得多項(xiàng)科學(xué)大獎(jiǎng)，包括歐洲腦科學(xué)獎(jiǎng)（2013年）[24]、美國(guó)科學(xué)突破獎(jiǎng)（2014年）和加拿大加德納獎(jiǎng)（2018年）[27]等?？梢灶A(yù)見，部分科學(xué)家還有望分享諾貝爾獎(jiǎng)。由于神經(jīng)生物學(xué)一直是諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)青睞的重點(diǎn)領(lǐng)域（10年內(nèi)平均1～2項(xiàng)），光遺傳學(xué)獲諾貝爾獎(jiǎng)也僅僅是時(shí)間問題。
科學(xué)啟示
通過光遺傳學(xué)的發(fā)展歷程，我們還可以得到如下啟示：
第一，微生物王國(guó)蘊(yùn)藏著無盡寶藏。從限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用（1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)和1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)），到耐高溫DNA聚合酶的使用（1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)），到視蛋白在光遺傳學(xué)的價(jià)值，再到今天基因編輯技術(shù)——CRISPR-Cas9系統(tǒng)，無一不是將微生物成分借助基因工程應(yīng)用到哺乳動(dòng)物。毫不夸張地說，基因工程及相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，微生物至少有一半以上的貢獻(xiàn)。
第二，基礎(chǔ)科學(xué)對(duì)技術(shù)革新意義重大。沒有上百年來對(duì)光受體孜孜不倦的研究，沒有20世紀(jì)70年代細(xì)菌視紫紅質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和功能研究，沒有藻類ChR的基因克隆，就不會(huì)有光遺傳學(xué)的誕生，因此，強(qiáng)化基礎(chǔ)研究對(duì)新技術(shù)的發(fā)明和完善具有十分重要的意義。
第三，技術(shù)進(jìn)步對(duì)科學(xué)發(fā)展的推動(dòng)作用。在知識(shí)日新月異的今天，許多科學(xué)問題的解決一方面依賴思維拓展，另一方面需要技術(shù)推進(jìn)。盡管光遺傳學(xué)的臨床應(yīng)用尚需時(shí)日，但這種技術(shù)手段對(duì)腦功能研究發(fā)揮了無法替代的作用，成為推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)發(fā)展的重要工具。
制版編輯 | 盧卡斯
