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撰文 | 商 周
責編 | 陳曉雪
在眾多的哺乳動物里，蝙蝠是一個較為特異的物種。因為有著獨特的免疫系統(tǒng)，它們可以和很多病毒長期共存。這樣的和平相處對蝙蝠來說是好事，但對其它哺乳動物就可能意味著麻煩。作為眾多病毒的自然宿主的蝙蝠，就像一個潛在的炸藥庫一樣，不定期地把危險釋放出來。比如我們熟悉的人類SARS病毒，還有更加致命MERS病毒，它們的自然宿主就是蝙蝠。而今年讓地球人都知道的新冠病毒，就像它的親戚SARS和MERS病毒一樣，同樣與蝙蝠冠狀病毒最為親近。雖然眾多讓人致病的病毒都源自蝙蝠，但因為人和蝙蝠接觸不多，而且兩者在進化上相差也較遠，所以一般病毒不會直接由蝙蝠傳給人。通常是蝙蝠把病毒傳給一個物種，病毒在這個物種身上進化一段時間以后再傳給人，這個在中間起到過渡的物種就叫中間宿主（可能是一個，也可能是多個）。比如駱駝是MERS的中間宿主，而SARS病毒的中間宿主之一是果子貍。那么全世界都在關心的新冠病毒SARS-CoV-2呢？根據(jù)中科院武漢病毒所的研究，在已知蝙蝠里的冠狀病毒中，和新冠病毒最為相似的是蝙蝠的冠狀病毒 RaTG13, 兩者在基因序列上的相似性達到了96.2% [1]。雖然這是一個很高的數(shù)字，但從分子進化的角度來說兩者相差還是比較遠,至少蝙蝠 RaTG13 病毒不可能直接一下突變成新冠病毒并傳給人，需要在另一個物種里完成那4%的大部分變異。這意味著，在蝙蝠和人類之間，很可能還是中間宿主的存在。而鑒定出這個中間宿主，無疑將幫助我們對新冠肺炎的防控。我們以SARS 病毒為例，看看果子貍是如何被鑒定為中間宿主的。因為SARS暴發(fā)的初期，一些病人是餐館里負責處理野生哺乳動物的工作人員，所以一個來自香港的研究團隊把目光集中到了深圳經(jīng)營野生動物的市場。通過對市場里的一些動物（包括海貍、雪貂、野兔、麂、貓、豬和果子貍等）取樣，他們發(fā)現(xiàn)果子貍身上帶有一種和SARS病毒在基因序列上相似程度達到99.8%的冠狀病毒，而且不是人傳給果子貍的 [2]。果子貍這個中間宿主，就是這樣被鑒定出來的。和SARS類似的事情也發(fā)生在了新冠病毒身上，早期的新冠病例里有不少和武漢華南海鮮市場有關聯(lián) [3]。所以一個可能的情形就是，新冠病毒的中間宿主出現(xiàn)在武漢華南海鮮市場里，科學工作者用同樣的方法就可以把它找出來。但出于防疫的考慮，華南海鮮市場在1月1日被關閉 [3]，中國疾控中心在當天從華南海鮮市場獲取了一些動物和環(huán)境標本。根據(jù)新聞報道，檢測結果表明在市場里的22個攤位和1個垃圾車上有新冠病毒存在 [4]，而動物身上卻沒有發(fā)現(xiàn)病毒 [5]。眾多攤位上出現(xiàn)了新冠病毒，確認了這個病毒在華南海鮮市場上的存在；而所檢測的動物身上沒有發(fā)現(xiàn)病毒，一個可能的解釋是所檢測的動物的種類和數(shù)量不夠。因為華南海鮮市場關閉得早，除了中國疾控中心的人員外，目前并沒有看到是否有其他單位的研究人員獲得了市場里的動物標本，并利用市場里的動物做進一步的研究的報道。不過，這也不意味著就沒辦法了。研究人員正在使出各自不同的招數(shù)去開展這項工作。讓我們一起看看，到目前為止有哪些動物被認為可能是中間宿主，科學家又是如何提出假設、如何去驗證、如何評價同行工作的。率先登場是來自中國北京大學等五個科研單位的團隊。1月17日，他們完成了關于新冠病毒中間宿主的研究論文并投稿到《 Journal of Medical Virology 》（醫(yī)學病毒學雜志），四天后被接受并發(fā)表 [4]。這項研究給出的結論讓人驚訝不已：中間宿主可能是蛇。圖片來源：www.pixabay.com
這一結論難免讓人驚訝，因為蝙蝠和人都是哺乳動物，而蛇是爬行類。如果病毒要在蝙蝠和人之間找一個中間宿主，一個更符合邏輯的選擇應該也是一種哺乳動物，而不是爬行類。那么，作者是如何得出這個 “不太符合邏輯” 的答案的呢？先看作者的科學假設：病毒和它的宿主在 “同義密碼子偏好” 上應該相近。這一假設聽上去好像有點道理，病毒為了更好地在宿主細胞里生存，那么它最好和宿主有著同樣的同義密碼子偏好。這樣，通過對病毒和可能的宿主進行同義密碼子偏好分析，可以為尋找病毒可能的宿主提供依據(jù)。接下來看作者的研究發(fā)現(xiàn)：在武漢菜市場常見的幾種動物（蛇、雞、穿山甲、蝙蝠、旱瀨、蝙蝠等），新冠病毒和蛇在同義密碼子偏好最為相近。根據(jù)這一主要發(fā)現(xiàn)，作者認為蛇可能是新冠病毒的中間宿主。一方面，作者沒有證明他們的假設的基礎是合理的。雖然病毒和和宿主在同義密碼子偏好上相似的確會對病毒有利，但這不意味著中間宿主就一定和病毒在這一點上相近。要證明這一假設的合理性，可以用已知中間宿主的病毒來驗證一下。比如找SARS病毒和果子貍，看看它們在同義密碼子偏好上是否相似。因為新冠病毒和SARS病毒相近，使用的同義密碼子也非常相似。根據(jù)作者的結果來看，一個肯定可以預測到的事實是：在同義密碼子偏好上，蛇比果子貍更和SARS病毒相似。但事實顯然并非如此。也就是說，作者的假設的基礎并不合理。另一方面，就算作者的假設合理，那么選取作為研究對象的動物也是一個問題。這項研究選擇了蛇、雞、穿山甲、蝙蝠、旱瀨和蝙蝠，那么如果再多家?guī)讉€物種（尤其是比蛇更 “低級” 一點的物種），會出現(xiàn)什么結果呢？一項來自美國密歇爾根大學的研究回答了這一問題，他們把同樣在菜市場常見的青蛙加進去分析，結果發(fā)現(xiàn)：在同義密碼子偏好上，青蛙比蛇更和SARS病毒相似 [5]。所以，通過分析同義密碼子偏好，這個團隊并沒有證明蛇是新冠病毒的宿主。有趣的是，蛇并不是唯一被認為可能是新冠病毒中間宿主的爬行類動物，另一個是烏龜。烏龜給人的印象是長壽，但其實它還有另外一個特點，就是也能和很多病毒和平共處。從這個意義上來說，烏龜有點像爬行類動物里的蝙蝠。另外，烏龜也在菜市場常見，這也吸引到了科研人員的注意力。圖片來源：www.pixabay.com
開展這項研究的，是來自湖北醫(yī)科大學等四個單位組成的研究團隊。有趣的是，這一項研究同樣發(fā)表在《 Journal of Medical Virology 》（醫(yī)學病毒學雜志）上。從投稿到接受只有短短的5天 [8]。所發(fā)表的論文截圖
先看作者的假設：新冠病毒的S蛋白和宿主的ACEII有著更好的結合力，所以有能夠與新冠病毒S蛋白結合力更好的ACEII的物種就可能是中間宿主。這個假設聽上去也有些道理，病毒的S蛋白和宿主的ACEII結合讓病毒進入宿主細胞，所以宿主的ACEII應該能和新冠病毒的S蛋白結合，而且結合越好越有利于病毒的感染。再看作者的發(fā)現(xiàn)：作者用生物信息學的方法模擬了S蛋白和ACEII結合的情況，通過分析了多個動物（人、猩猩、猴子、倉鼠、貓、狗、穿山甲、蛇、烏龜、蝙蝠、小鼠）的ACEII的蛋白上和S蛋白結合的關鍵氨基酸，他們認為烏龜?shù)腁CEII和新冠病毒結合最好。所發(fā)表論文截圖
根據(jù)這一結果，作者認為烏龜可能是新冠病毒的中間宿主。主要是兩個方面：第一，作者同樣沒有證明他們的假設的合理性。就像上面提到的一樣，這種合理性可以用已知的病毒和它們的宿主來驗證，比如用SARS病毒和果子貍。第二，作者在評估S蛋白和ACEII的結合能力的時候，并沒有給出一個量化的指標，而只是一個定性的分析。實際上，在后來的一項于4月1日提交到 ChemRxiv 網(wǎng)站的研究中，一個來自華中科技大學的團隊把這些都做了 [9]。通過分析蝙蝠冠狀病毒RaTG13的S蛋白與82個動物ACEII的結合力發(fā)現(xiàn)，自然宿主（蝙蝠）的ACEII不僅不是與它的S蛋白結合得最好的，就是連前幾名都沒有排上。換句話說，通過分析病毒S蛋白與動物得ACEII的結合力的方法，并不適合用來鑒定病毒的宿主。所以，認為烏龜是新冠病毒的宿主的觀點同樣沒有給出讓人信服的證據(jù)。蛇和烏龜都是爬行類，它們成為新冠病毒的中間宿主的可能性不大，并不是說完全沒有可能。科學上提倡大膽假設，但同時需要小心求證。顯然，提出蛇和烏龜是中間宿主的兩項研究只做到了前者。
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狗是常見的人類寵物，是和人類接觸最密切的動物之一。當聽到狗可能是新冠病毒的中間宿主的時候，不少人都會暗暗擔心。別著急，還是先看看論文。
4月14日，《 Mol.Biol.Evol. 》（分子生物和進化）雜志發(fā)表了一篇的題為“ Extreme genomic CpG deficiency in SARS-CoV-2 and evasion of host antiviral defense ” 的論文，作者來自加拿大渥太華大學 [10]。
就像題目里體現(xiàn)的那樣，這項研究主要探討的并不是誰是新冠病毒的中間宿主，而是尋找新冠病毒的一些特點，然后試圖從病毒與宿主共同進化的角度上去給予解釋。
作者研究的新冠病毒的CpG的含量。CpG是基因序列上的C和G兩個連在一起的堿基的縮寫，在脊椎動物中CpG的含量很低，而且有被甲基化的傾向。而在微生物的基因組中CpG的含量較高，甲基化的傾向也低。所以我們的免疫系統(tǒng)可以利用這一點，去識別微生物并對它們進行攻擊。我們的細胞里負責識別病毒CpG的，是一個名叫ZAP的分子。
當然，面對這樣的打擊，病毒也會有相應的辦法。在ZAP分子的高壓下，一些病毒就會盡量去降低自己的CpG 的含量。
在這項研究里，作者就發(fā)現(xiàn)新冠病毒，還有和它相近蝙蝠冠狀病毒RaTG13，有著較低的CpG 含量。而且在作者調查的眾多動物冠狀病毒里，只有狗身上的幾個冠狀病毒CpG的含量也很低，和新冠病毒相當（見下圖）。
發(fā)表論文結果截圖
作者認為，狗的多個冠狀病毒的CpG含量低，說明了狗的細胞里的ZAP分子對冠狀病毒的壓力可能很大。根據(jù)這一點，作者在論文的討論里對新冠病毒的起源做了一個這樣的推測：“首先，新冠病毒和蝙蝠RaTG13病毒的祖先感染了狗的腸道，比如通過狗獵食蝙蝠進入；其次，這個病毒在狗的細胞里因為ZAP分子的壓力，而進化出了較低的CpG含量；最后，有著較低CpG含量的病毒再傳播到其他物種（比如人）的時候，人的ZAP分子可能對這個病毒就沒有多大的威力，所以病毒的致病能力就增強了。”如果按這種說法，狗就不是新冠病毒的中間宿主，而是遠古以前的一段時間里的宿主而已。但作者又做了進一步的補充：“然而，也存在一種這樣的可能，這里面的一支冠狀病毒最近在狗的腸道系統(tǒng)里獲得了較低的CpG含量，然后再傳染到其它物種身上”。顯然，作者在這里暗示，狗有可能是新冠病毒的中間宿主了。應該說，這項研究還是相對嚴謹?shù)?，作者并沒有直接聲明狗就是新冠病毒的中間宿主，而是暗示存在這種可能。作為百姓，人們關心的是狗到底有沒有可能是新冠病毒的中間宿主。如果是，那無疑將會影響到百姓的生活。給出否定答案的是來自中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所的一個團隊。在這項研究里，作者通過用新冠病毒去感染一些和人類有接觸的動物，發(fā)現(xiàn)雪貂和貓對新冠病毒易感，而病毒在狗、豬、雞和鴨的身體里則很難增殖，更不會導致傳染。上面談到的蛇、烏龜以及狗，它們被認為可能是新冠病毒中間宿主的證據(jù)都不是實驗性的，而是根據(jù)一些生物信息學的分析。研究人員之所以不能用實驗性的直接證據(jù)來說明問題，一個重要的原因就是這樣的證據(jù)不容易獲得。就像鑒定出SARS病毒的一個中間宿主一樣，直接證據(jù)就是從果子貍身上分離出了和SARS病毒高度相似的冠狀病毒。當然，不少研究人員在為此付努力。而且也發(fā)現(xiàn)了一些有意思的線索，這就是穿山甲的冠狀病毒。從二月份開始，先后有至少四個團隊（2個來自廣東，1個來自云南，1個來自香港）發(fā)表了關于發(fā)現(xiàn)穿山甲冠狀病毒的論文 [11-14]。這個新發(fā)現(xiàn)的穿山甲冠狀病毒與新冠病毒在基因序列上的相似性為91%左右，低于蝙蝠 RaTG13 CoV 與新冠病毒的相似性（96%）。而這三個病毒的關系，基本上可以用下面這個圖來總結：圖片來源：參考鏈接[13]
1. 在全基因組水平上，蝙蝠RaTG13 CoV 和新冠病毒更相近，而穿山甲冠狀病毒遠一些。
2. 在與ACEII結合的幾個關鍵的氨基酸上，穿山甲冠狀病毒和新冠病毒更加相近，而蝙蝠RaTG13 CoV遠一些。3. 在新冠病毒上的一個插入的FURIN酶切位點上，蝙蝠RaTG13 CoV和穿山甲冠狀病毒更加相近，而新冠病毒遠一些。因為從穿山甲身上分離出的冠狀病毒和新冠病毒只有91%的相似性，我們不能認定穿山甲就是新冠病毒的中間宿主。但同時也不能排除這種可能，因為穿山甲冠狀病毒的發(fā)現(xiàn)說明，新冠病毒可能可以在穿山甲身上存在。
那么，除了穿山甲外，哪些物種還可能成為新冠病毒的中間宿主呢？確定一個物種是中間宿主很難，但認定一個物種不是中間宿主則要容易得多，而且這樣的排除法也會給我們控制新冠病毒帶來一定的幫助。最近，一篇發(fā)表在《 Transbound Emerg Dis. 》雜志上的論文就這個問題做出了探討。來自西北農(nóng)林大學、北京農(nóng)業(yè)大學以及洛陽國家獸醫(yī)研究中心的研究人員測試了35種動物（共1914只）的血清，檢測它們是否有針對新冠病毒的抗體 [15]。發(fā)表論文截圖
這項研究的假設是：感染有新冠病毒的中間宿主應該會產(chǎn)生針對該病毒的抗體，所以通過檢測動物血清里的抗體的方法能確定這個動物是否感染有新冠病毒。如果沒有，那就可以排除這種動物作為中間宿主的可能。我們先來看這項研究發(fā)現(xiàn)了什么。發(fā)表論文結果截圖
結果就像上圖所示，35個物種，1914只動物，包括實驗室動物、家禽、寵物、以及野生動物的血清全部是陰性，都沒有針對新冠病毒的抗體。根據(jù)這一結果，作者認為這35種動物都不可能是新冠病毒的中間宿主。1. 所檢測的動物選擇有問題。一是有些居然是實驗室里SPF動物，也就是沒有特定病原體的動物，這些動物當然不會有新冠病毒；二是方法部分并沒有給出具體的詳細的動物信息，比如采集地點和時間，這同樣會影響到實驗的結果。
2. 也是更重要的，有限量的動物的血清里沒有抗體，并不能代表這個物種不是中間宿主，因為完全可能是抽樣的時候沒有抽到感染的動物。一個例子就是果子貍，它是SARS病毒的一個中間宿主，研究人員就發(fā)現(xiàn)大量的果子貍（尤其是野外生長的）并沒有被SARS病毒感染 [16]。所以，根據(jù)這樣的實驗結果，把上面35種常見的動物排除在中間宿主之外，是一個并不謹慎的做法。既然通過檢測血清里針對新冠病毒的抗體的方法難以排除中間宿主，那么哪一種方法才是可取的呢？作為可能的中間宿主，它必須滿足一個條件：能被新冠病毒感染，病毒能在它的體內增殖，而且能再從它身上再傳給其它動物。以上標準的檢驗過程，可以在實驗室里進行，也可以通過分析自然的感染（比如通過病人傳給動物）來獲得答案。數(shù)據(jù)來源：參考鏈接[17]
毫無疑問，這個表格還需要完善。只有更多的可能在華南海鮮市場上出現(xiàn)的動物（尤其是哺乳動物）的信息完整之后，我們在這一問題上才能有更好的了解。但從現(xiàn)有的情況來看，家禽、狗、豬都可以被排除，因為它們不易感；而其它動物都有成為中間宿主的可能，雖然可能性的大小不一。還有一點不能排除的是，可能不需要中間宿主，蝙蝠直接把病毒傳給人類。總之，雖然相關領域的研究論文已經(jīng)有了十余篇，但鑒定新冠病毒的中間宿主的工作遠沒有完成。因為缺乏華南海鮮市場的標本，研究人員不得不采取各種間接的方法去努力。鑒定新冠病毒的中間宿主可能還會是一個漫長的過程，正是在這個過程里，研究人員的科學精神和科學方法得到彰顯。
參考鏈接
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