開荒者許悅：好運在第366次降臨 | 科研外史
進(jìn)入前人沒有踏足過的荒地，對于膽小者而言是前途未卜避猶不及的窮山惡水，但對于真正的勇者，卻是大展身手封狼居胥的良田沃土。
北京生命科學(xué)研究所邵峰博士實驗室的許悅博士，在六年半曲折的博士生涯中，在幾次實驗遇到瓶頸之時都沒有輕言放棄，最終攻克了天然免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)異源自噬的重要問題。本文講述了許悅博士自2013年到2019年間的研究歷程，與讀者分享她在科研道路上的探索故事。
撰文 | 黃宇翔
編輯 | 金莊維
尋寶（2013.3-2014.4）
366-C7突變體的發(fā)現(xiàn)，是整個故事的開始。 許悅博士
當(dāng)許悅在2013年3月定導(dǎo)于北京生命科學(xué)研究所邵峰博士實驗室時，沒有什么人能想到這個外表文靜低調(diào)的北京姑娘有一天能攻克天然免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)異源自噬的重要問題。
“安靜專注而堅韌的小女孩，有時讓你感覺不到她的存在。”這是她在高中生物學(xué)老師張慧心目中留下的印象。也許正是這種品質(zhì)，幫助她在六年半曲折的博士生涯中，在幾次實驗遇到瓶頸之時都不輕言放棄，最終守得云開見月明。
彼時在天然免疫學(xué)領(lǐng)域，異源自噬（Xenophagy）正是一個火熱的話題。長久以來，人們一直認(rèn)為健康的“守衛(wèi)部隊”——免疫系統(tǒng)——專職負(fù)責(zé)保護(hù)機(jī)體抵抗病原菌的侵襲。但在2004年，兩個研究團(tuán)隊獨立地發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象：一些原本被認(rèn)為手無縛雞之力的正常組織細(xì)胞，在面對兇惡的入侵病原菌面前，并不會坐以待斃，而是會成立“敵后武裝”，在細(xì)胞內(nèi)將入侵者包圍住，送往細(xì)胞內(nèi)的“垃圾回收站”溶酶體中進(jìn)行清除處理。研究者將這種宿主細(xì)胞通過將入侵病原菌包圍并清除的過程稱作異源自噬。
到了2012年前后，《自然》、《科學(xué)》等頂級期刊上連續(xù)發(fā)表幾篇論文，找到了一些可能參與宿主細(xì)胞在實現(xiàn)對入侵病原菌進(jìn)行“垃圾的分類回收”過程調(diào)控的分子，提出宿主細(xì)胞能在病原菌蛋白上插上一種叫做“泛素”的標(biāo)簽，將其標(biāo)志為“有害垃圾”，進(jìn)而送往垃圾處理場進(jìn)行銷毀[1-3]。
北京生命科學(xué)研究所的邵峰團(tuán)隊，長期關(guān)注病原菌的致病機(jī)制與宿主細(xì)胞的免疫抵抗，所以他們自然不會放過這條宿主細(xì)胞的抵抗通路。
經(jīng)過仔細(xì)地閱讀異源自噬方面的文獻(xiàn)報道，邵峰實驗室的師生們敏銳地關(guān)注到當(dāng)時幾篇熱門研究存在漏洞：
首先，盡管在研究者普遍認(rèn)為泛素化修飾是觸發(fā)異源自噬的關(guān)鍵步驟，但當(dāng)時還沒有任何團(tuán)隊報道鑒定出介導(dǎo)此過程的泛素底物或泛素連接酶；
其次，當(dāng)時研究異源自噬的實驗體系存在缺陷：細(xì)胞只會對不足20%的入侵細(xì)菌產(chǎn)生自噬響應(yīng)。由于好的體系對闡釋清楚具體的機(jī)制至關(guān)重要，因此在自噬響應(yīng)率如此低的體系下作出的結(jié)論有多扎實可靠，是需要被質(zhì)疑的。
2013年的春天，負(fù)責(zé)指導(dǎo)新生許悅做實驗的博后師兄陸秋鶴在探索異源自噬機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)了一個現(xiàn)象，而這個觀察可能是許悅此后一系列研究發(fā)現(xiàn)的源頭。
細(xì)胞有一套垃圾回收的機(jī)制，比如當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的“發(fā)電站”線粒體使用壽命達(dá)到淘汰標(biāo)準(zhǔn)時，細(xì)胞能有一套將其送到垃圾回收站，將其分解為能被細(xì)胞二次利用的能量物質(zhì)，這個細(xì)胞內(nèi)部變廢為寶的過程稱作細(xì)胞自噬（Autophagy），在2016年被授予了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。轉(zhuǎn)錄因子TFEB在細(xì)胞自噬的過程中發(fā)揮了一個傳話員的職責(zé)，它在閑暇的時候會待在細(xì)胞質(zhì)中游蕩，一旦細(xì)胞有了進(jìn)行細(xì)胞自噬的需要，它就會接到上級領(lǐng)導(dǎo)mTOR通路的命令，進(jìn)入到細(xì)胞核里，結(jié)合在一系列編碼細(xì)胞自噬效應(yīng)分子的基因上游，通過轉(zhuǎn)錄激活作用，“叫醒”休息中的垃圾回收站工作人員，催促他們盡快到崗。
陸秋鶴博士發(fā)現(xiàn)，在異源自噬激活時，能觀察到明顯的TFEB入核行為，說明這個細(xì)胞內(nèi)在“垃圾回收”過程中負(fù)責(zé)傳令的轉(zhuǎn)錄因子，在集結(jié)兵力對抗入侵病原菌的過程中可能也發(fā)揮了作用。
經(jīng)過進(jìn)一步的實驗，陸秋鶴發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在異源自噬情景下，很可能不是mTOR通路調(diào)節(jié)TFEB入核。于是，他繼續(xù)找尋宿主細(xì)胞中激活TFEB的機(jī)制。
一個金礦出現(xiàn)在了眼前：細(xì)菌的哪些成分觸發(fā)了宿主細(xì)胞的TFEB轉(zhuǎn)移入核呢？
換句話說，邵峰團(tuán)隊想問的科學(xué)問題是，當(dāng)病原菌入侵進(jìn)入細(xì)胞后，是病原菌中的哪些成分觸發(fā)了“警報”，導(dǎo)致TFEB這個傳令官得到了訊息，繼而快馬加鞭奔入細(xì)胞核？
圖 1. 細(xì)胞中的垃圾處理機(jī)制。左圖為細(xì)胞自噬的示意圖，表示細(xì)胞如何將自身產(chǎn)生的“可回收垃圾”進(jìn)行分解，變廢為寶；右圖為異源自噬的示意圖，表示宿主細(xì)胞面對“有害垃圾”病原菌的入侵，如何奮起反擊。（圖源：Huang et al., (2014) Nature Reviews Microbiology）
但是，面對一整片待開墾的處女地，該如何下手研究呢？
“當(dāng)研究沒有什么頭緒的時候，就去做個篩選吧。”邵峰老師對博士選題還沒有方向的一年級新生許悅說道。
在眼睛看不清周圍景物、找不到研究的明確目標(biāo)時，做一個遺傳學(xué)篩選，就像是撒出一張大網(wǎng)，有可能會打開新的局面。
邵老師建議許悅在被異源自噬領(lǐng)域普遍使用的沙門氏菌中進(jìn)行遺傳學(xué)篩選。具體來說，就是通過一種來自于噬菌體神奇分子工具——轉(zhuǎn)座子，能隨機(jī)插入沙門氏菌基因組中，進(jìn)而極大概率破壞某個基因的功能。如果能找到這樣一株細(xì)菌突變體，侵染細(xì)胞后不再能引起“傳令官”TFEB入核，那么這株突變體就很可能是編碼能觸發(fā)TFEB入核的效應(yīng)分子的基因發(fā)生了突變。假如能鑒定出這個基因，就有希望順藤摸瓜闡釋清楚細(xì)菌觸發(fā)異源自噬警報的機(jī)制。
同時，細(xì)菌的遺傳學(xué)篩選，對于一個缺乏經(jīng)驗的博士一年級新生而言，確實是一個不錯的選擇：
首先，在當(dāng)時，細(xì)菌的遺傳學(xué)篩選遠(yuǎn)遠(yuǎn)簡單于哺乳細(xì)胞的遺傳學(xué)篩選，這是因為不同于雙倍體的哺乳動物細(xì)胞不同，細(xì)菌細(xì)胞是單倍體，只需要破壞單個基因就能夠?qū)崿F(xiàn)完全的基因敲除。而且，與哺乳細(xì)胞不同，細(xì)菌編碼的基因在基因組中排列緊密，且沒有內(nèi)含子，意味著隨機(jī)的插入有更高的概率破壞基因的功能；
其次，邵峰實驗室在細(xì)菌遺傳學(xué)篩選方面擁有豐富的經(jīng)驗，因此新手能從師兄師姐那里得到實驗細(xì)節(jié)方面更多的指導(dǎo)和幫助。
基于此，許悅在邵老師的指導(dǎo)下設(shè)計了這樣的一個遺傳篩選：在人的細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)一個融合紅色熒光蛋白的TFEB，用細(xì)菌遺傳突變體庫對其進(jìn)行侵染，在高通量顯微鏡下尋找能讓傳令官TFEB沉默停留在細(xì)胞質(zhì)不入核的細(xì)菌突變體。
此外，邵老師想到一個有意思、但有可能不存在的假設(shè)，沙門氏菌引發(fā)自噬的比例這么低，會不會存在抑制異源自噬的蛋白呢？考慮到篩選TFEB的同時加入另外一個熒光標(biāo)記GFP-LC3對于整個篩選并不會增加過多的工作量，邵老師建議許悅在設(shè)計實驗時同時篩選TFEB與LC3兩個表型。
后來的實踐證明，他們有心栽花所種下的試圖尋找TFEB入核的細(xì)菌觸發(fā)因子的嘗試并沒能開出花朵，但是無心插柳的另一個表型篩選，卻歷經(jīng)曲折，最終結(jié)出了豐碩的果實。
篩板子，是一項工作量不算輕的任務(wù)。
許悅將人細(xì)胞系培養(yǎng)在96孔板——96孔板是一塊手掌大小的塑料板，其中包含了96個互相獨立的豌豆大小的小孔，將好像是為細(xì)胞提供了96間獨立的公寓一樣。
同時，她還需要將一個個獨立的沙門氏菌突變體接種于96孔板，待細(xì)菌培養(yǎng)至合適的狀態(tài)后，一一對應(yīng)地去感染細(xì)胞。沙門氏菌會快速進(jìn)入細(xì)胞，在短短兩小時內(nèi)就可以觀察相應(yīng)的表型。隨后許悅將整塊96孔板在高通量顯微鏡下進(jìn)行拍攝，監(jiān)控每一個獨立“細(xì)胞公寓”中傳令官TFEB的入核以及異源自噬通路整體激活的水平。
每一批板子，從培養(yǎng)細(xì)菌鋪細(xì)胞，到最后在顯微鏡下拍攝獲得原始數(shù)據(jù)，一整套流程下來需要兩天時間。剛開始對于許悅來說，一次只能完成五塊板子。漸漸熟練之后，一次實驗可以操作十塊96孔板。
加上摸索實驗條件的時間，半年很快就過去了。許悅已經(jīng)篩完了預(yù)計的300個96孔板（每塊板中實際可以篩選58個沙門氏菌突變體），看過了將近兩萬個細(xì)菌突變體侵染宿主細(xì)胞的表型，除了發(fā)現(xiàn)很多影響細(xì)菌侵入細(xì)胞的突變體外，其他一無所獲。沙門氏菌共編碼4672個蛋白，考慮到轉(zhuǎn)座子的插入不一定會破壞基因的功能和篩選的隨機(jī)性等因素，目前檢測的300個板子并不十分保險。
“我再篩100個板子吧，如果還是篩不到，我們再想別的辦法。”許悅認(rèn)為好不容易建立起的篩選體系，這樣放棄有點可惜，于是跟邵老師建議道。
好運終于在篩選的第366塊板子上降臨。
圖2. 幸運的第366塊板子。許悅在沙門氏菌上開展的轉(zhuǎn)座子遺傳篩選示意圖，前365塊板子一無所獲，但上天終于在她篩到第366塊板子時眷顧了她。
2014年2月13日，剛剛過完春節(jié)。許悅已經(jīng)開始在高通量顯微鏡下拍攝新年后的第三批樣品了。
TFEB的信號如往常一樣，在細(xì)菌的侵染下紛紛入核，看來又都是陰性的結(jié)果。
但是，當(dāng)她將顯微鏡切換到綠色通道時，一個散發(fā)出一簇簇亮眼熒光信號的小孔立刻吸引了她的眼球——與綠色熒光彌散在整個細(xì)胞質(zhì)中的此前兩萬多個樣品不同，在這個小孔中綠色熒光信號仿佛被磁鐵吸附了一樣，匯聚成了一簇簇光點。在漆黑一片的背景下，好像是夜空中一顆顆閃亮的明星，散發(fā)出迷人的光亮。
大半年陰性結(jié)果籠罩的探索黑夜，此刻終于浮現(xiàn)出了點點星光。
這個突變體出現(xiàn)在篩選的366號板編號為C7的小孔中，因此許悅將這個突變體命名為366-C7。
366-C7突變體的表型非常有趣：野生型的沙門氏菌侵染細(xì)胞時，只能比較微弱地引發(fā)細(xì)胞異源自噬通路的激活，因此GFP-LC3的熒光信號總是彌漫在細(xì)胞質(zhì)中；366-C7突變菌侵染細(xì)胞，卻會引發(fā)GFP-LC3的聚集，表明宿主細(xì)胞的異源自噬通路大幅度增強(qiáng)，說明366-C7株系很可能是一個細(xì)菌中原本會抑制宿主細(xì)胞異源自噬通路激活的基因發(fā)生了突變。
利用分子生物學(xué)技術(shù)，許悅很快鑒定出366-C7突變體在基因組中插入的位置：一個編號為SL1344_1177的基因被破壞。1177代表這是該沙門氏菌株系的第1177個基因，對于這個基因，NCBI數(shù)據(jù)庫中只顯示它包含了374個氨基酸。至于結(jié)構(gòu)和功能，當(dāng)時還沒有任何記載。
看來是挖到寶了。許悅心中竊喜。
進(jìn)入前人沒有踏足過的荒地，對于膽小者而言是前途未卜避猶不及的窮山惡水，但對于真正的勇者，卻是大展身手封狼居胥的良田沃土。
緊接著完成了的1177號基因的定向突變和回補(bǔ)實驗的結(jié)果，進(jìn)一步鞏固了她的猜想：1177號基因是一個全新的沙門氏菌觸發(fā)自噬通路的抑制因子。并且它是沙門氏菌III型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白，可以直接進(jìn)入真核細(xì)胞中發(fā)揮功能。
邵老師后來決定將這個基因命名為SebX，代表沙門氏菌中抑制異源自噬的效應(yīng)分子（Salmonella effector blocking Xenophagy）。更有意思的是，SebX對其他細(xì)菌引起的自噬同樣具有抑制效果，但對于已經(jīng)研究得非常清楚的經(jīng)典自噬通路卻沒有影響。
圖3. SebX突變體的表型。與其他突變體相比，366-C7突變體（右上）中GFP-LC3呈現(xiàn)明顯聚集狀態(tài)。許悅經(jīng)過基因定位發(fā)現(xiàn)這個突變體是一個以前從未被報道過的基因發(fā)生了突變，最初將它命名為SebX。
2014年的4月，許悅正式成了第一個發(fā)現(xiàn)沙門氏菌編碼抑制異源自噬蛋白的人。但還沒來得及慶祝，她很快就陷入了這片新大陸上迷霧與泥沼的重重包圍之中。
迷霧（2014.4-2015.1）
SebX抑制異源自噬的機(jī)制是什么？這是橫亙在許悅面前的重要問題。要想回答這個問題，按照常規(guī)的思路一般會從兩個方面入手：
第一，大多數(shù)細(xì)菌效應(yīng)蛋白都是酶，也就是說能催化生物體內(nèi)特定化學(xué)反應(yīng)的高效發(fā)生。因此，許悅前進(jìn)的一個方向是去探尋SebX在細(xì)胞內(nèi)所能催化的生化反應(yīng)，即嘗試去找到這個蛋白的酶學(xué)活性。
第二，假若SebX有酶活性，還可以通過尋找與它存在相互作用的蛋白組分，鑒定出它所催化的反應(yīng)的底物，進(jìn)而更好地理解它作用的機(jī)制。
但在當(dāng)時，還沒有一篇對于SebX的研究記載，看來前人從未對這個蛋白有過研究。缺乏線索的許悅此刻仿佛身處在一團(tuán)迷霧之中。
基于自噬通路中已闡明的機(jī)制以及邵峰團(tuán)隊過往研究細(xì)菌效應(yīng)分子的豐富經(jīng)驗，許悅提出了關(guān)于SebX可能作用機(jī)制的七種假設(shè)，仿佛是制作了七條錦囊妙計，并逐一設(shè)計實驗對其進(jìn)行驗證。
七個錦囊逐一被許悅拆開了——她用嚴(yán)謹(jǐn)扎實的實驗數(shù)據(jù)將自己此前所作出的假設(shè)一一推翻。
“看來我們已經(jīng)積攢了七個Supplementary的數(shù)據(jù)。”邵老師在與許悅討論陰性實驗結(jié)果時開著玩笑說道。
大半年的時光在拆錦囊的過程中無聲無息地流走了，許悅的課題在迷霧中兜了七個圈子，最終還是回到了原地。
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聯(lián)手（2015.1-2016.4）
我必須承認(rèn)，幸運喜歡照顧勇敢的人。 查爾斯·達(dá)爾文（1809-1882）
周平博士是在2015年年初的時候參與到許悅的課題研究中的。周平在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉榜教授實驗室獲得博士學(xué)位，博士期間用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對豬呼吸道病毒感染肺部巨噬細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行研究。懷著對天然免疫系統(tǒng)的強(qiáng)烈興趣，他在2012年作為博后加入了邵峰實驗室。
可是，四周霧氣這么重，他們怎么才能打開研究的突破口呢？
“當(dāng)研究沒有什么頭緒的時候，就去做個篩選吧。”邵峰老師云。
希望再一次寄托在遺傳學(xué)篩選這張看上去無所不能的神奇大網(wǎng)上。
但是，與對細(xì)菌進(jìn)行遺傳篩選不同，對哺乳動物進(jìn)行遺傳篩選更加困難。真核細(xì)胞是二倍體，而且基因組中真正編碼蛋白質(zhì)的比例僅占全基因組序列的1%左右。在21世紀(jì)的第一個十年里，基于RNA干擾技術(shù)對哺乳動物細(xì)胞作遺傳學(xué)篩選是當(dāng)時技術(shù)限制下最好的方法，但依然困難重重。
但就在許悅博士一年級期間，生物學(xué)領(lǐng)域所發(fā)生的一項歷史性突破，大大降低了哺乳細(xì)胞遺傳篩選的難度。
2013年初，麻省理工學(xué)院的張鋒團(tuán)隊報道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對真核細(xì)胞的基因組進(jìn)行高效編輯，并且很快設(shè)計出幾乎覆蓋全基因組的gRNA文庫。周平博士的工作內(nèi)容之一便是在這一技術(shù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計CRISPR/Cas9遺傳篩選體系，尋找參與異源自噬的關(guān)鍵基因[4, 5]。
可是由于課題的特殊性質(zhì)，建立回答這個特定問題的CRISPR遺傳篩選系統(tǒng)的道路注定充滿荊棘：利用CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行遺傳篩選的原理，是希望能通過某一表型將感興趣基因被敲除的細(xì)胞與其他基因敲除的細(xì)胞分開，再通過對基因組文庫進(jìn)行測序通過gRNA的富集將感興趣的基因找出來。這個表型需要足夠強(qiáng)，比如細(xì)胞的死活是CRISPR篩選系統(tǒng)被最常使用的判斷表型——假如研究者想研究癌細(xì)胞對化療藥產(chǎn)生抵抗的機(jī)制，就可以用藥物去殺傷癌細(xì)胞，沒被殺死的癌細(xì)胞很可能就是在化療藥作用的通路上的基因被敲除，進(jìn)而可以免疫藥物的殺傷。
那么該如何設(shè)計實驗，才能將發(fā)生異源自噬和不發(fā)生異源自噬的宿主細(xì)胞區(qū)分開呢？
GFP-LC3的熒光信號在細(xì)胞內(nèi)的分布變化可以是反映異源自噬水平的標(biāo)志：許悅當(dāng)初發(fā)現(xiàn)366-C7，就是觀察到異源自噬水平強(qiáng)的細(xì)胞中GFP-LC3聚成了一簇簇明亮的小團(tuán)，而異源自噬水平低的細(xì)胞中GFP-LC3是彌散在整個細(xì)胞質(zhì)中的。
但存在一個很大的問題：GFP-LC3熒光信號在亞細(xì)胞水平分布上的差異可以在顯微鏡下通過人眼分辨，但一次遺傳學(xué)篩選要考察上億個細(xì)胞的GFP-LC3熒光信號分布差異，僅憑周平和許悅兩雙眼睛來看，恐怕花上幾十年也看不完。
流式細(xì)胞儀可以基于細(xì)胞熒光強(qiáng)度的不同，以每秒鐘上萬個細(xì)胞的速度對細(xì)胞進(jìn)行分選，看上去是一個不錯的解放人力的方案。
但是問題來了：一般流式細(xì)胞儀只能測量出每個細(xì)胞整體的熒光強(qiáng)度，但對于細(xì)胞來說，異源自噬水平高低差異，僅僅體現(xiàn)在綠色熒光信號的分布上，在整個細(xì)胞水平，熒光信號強(qiáng)度并沒有出差異。也就是說：低通量人眼能辨別的差異，高通量的儀器覺察不出來。
遇到如此大的困難，不如就此放棄了吧？
這個時候，周平博士對問題進(jìn)行了仔細(xì)的思考：他想，流式細(xì)胞儀區(qū)分不出細(xì)菌自噬水平不同細(xì)胞的本質(zhì)，是一個關(guān)于信噪比的問題。對于細(xì)菌自噬水平高的細(xì)胞而言，有效的信號其實是在膜泡上聚集成團(tuán)的GFP-LC3，散布在細(xì)胞質(zhì)中的GFP-LC3是干擾檢測的背景噪音；在細(xì)菌自噬水平低的細(xì)胞中，彌散在細(xì)胞質(zhì)中的“噪音”實在是太強(qiáng)了，以至于鳩占鵲巢，掩蓋了希望檢測的信號。因此，要想幫助儀器辨別出兩類細(xì)胞的差異，關(guān)鍵需要在提高信噪比方面下功夫。
提高信噪比，一種思路是提升信號本身強(qiáng)度，另一種是降低背景信號。為了實現(xiàn)第一點，周平博士首先在細(xì)菌中表達(dá)了一類黏附分子AFA，使得細(xì)菌能通過結(jié)合宿主細(xì)胞表面分子CD55，粘在細(xì)胞表面，從而使得更高比例的細(xì)菌能進(jìn)入細(xì)胞感染，更多的細(xì)胞的細(xì)菌自噬通路被激活，從而觀察到更多的細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)團(tuán)的綠色熒光信號。
如何才能降低細(xì)胞質(zhì)中熒光信號背景呢？周平從物理化學(xué)的角度進(jìn)行思考：聚團(tuán)的GFP-LC3和彌散的GFP-LC3不同之處在于，前者經(jīng)過脂質(zhì)修飾，附著在膜上，而后者水溶性較強(qiáng)。基于這一本質(zhì)上的差別，周平博士萌生了一個精巧的想法：假若能用一種試劑，在細(xì)胞膜上打一些小孔，讓水溶性的GFP-LC3流出，細(xì)胞中只留存脂溶性的聚團(tuán)的GFP-LC3，如此處理過后的兩類細(xì)胞熒光信號強(qiáng)度的差異，不就能被流式細(xì)胞儀識別了嗎？
基于2010年瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院McInerney實驗室的一篇報道，周平博士用一種比較弱的去垢劑——皂苷（saponin）——處理細(xì)胞，驚喜地發(fā)現(xiàn)這種方法能將背景降到足夠流式細(xì)胞儀分辨兩組細(xì)胞的程度[6]。如此處理過后，似乎就能通過流式細(xì)胞儀將感興趣的少數(shù)異源自噬通路被抑制的細(xì)胞從大量異源通路正常被激活的細(xì)胞中分選出來，進(jìn)而通過研究這些細(xì)胞中g(shù)RNA的富集程度，推斷細(xì)胞中哪些基因的破壞會導(dǎo)致異源自噬通路的抑制。
找到了看上去如此理想的條件，周平迫不及待地展開了第一輪篩選。
然而經(jīng)歷了忙碌的兩個月，當(dāng)看到測序分析的結(jié)果后，周平和許悅都有點失望：按照他們原先的設(shè)想，在異源自噬通路被抑制的細(xì)胞中，應(yīng)該能檢測到那些此前已知的參與到異源自噬過程的基因，現(xiàn)實卻是，他們并沒有觀察到這些陽性對照gRNA的富集。
本來冀望通過撒網(wǎng)的方式希望能尋找突破口，可忙活了半天拿到結(jié)果之后才發(fā)現(xiàn)，自己在用的原來是一張破網(wǎng)。
換句話說，就是實驗的結(jié)果非常糟糕，遺傳篩選的體系還需要進(jìn)一步優(yōu)化，這次篩選得到的候選基因沒有任何科學(xué)意義。
為什么篩選會失??？周平很快從失落中調(diào)整過來，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行冷靜的思考。他發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前的方法主要存在兩個很大的問題：第一，GFP-LC3信號的強(qiáng)度是連續(xù)的，因此在流式細(xì)胞儀上如何劃分選擇的界限，是一個容易因為主觀因素引入偏差的步驟；其次，使用表達(dá)AFA的菌株進(jìn)行侵染，固然提升了侵染效率，但同時由于在GFPlow細(xì)胞亞群中依然存在大量未發(fā)生異源自噬的假陽性細(xì)胞，嚴(yán)重影響了篩選的質(zhì)量。
在把網(wǎng)再次撒出以前，得把這張網(wǎng)上的漏洞一一補(bǔ)牢才行。補(bǔ)網(wǎng)的第一步，是希望能找到一個客觀的劃分綠色熒光閾值的標(biāo)準(zhǔn)。周平博士絞盡腦汁，想到了一個絕好的參照系，即將攜帶了另一種紅色熒光蛋白不經(jīng)歷gRNA文庫敲除、同時異源自噬下游一個關(guān)鍵效應(yīng)基因ATG5敲除的對照細(xì)胞從細(xì)菌侵染的步驟開始就與實驗組細(xì)胞混在一起處理，作為劃界的標(biāo)準(zhǔn)。
接下來挑戰(zhàn)第二個漏洞——如何才能降低假陽性細(xì)胞的干擾呢？經(jīng)過冷靜的分析，周平發(fā)現(xiàn)，問題的關(guān)鍵出在那些表面黏附有細(xì)菌、但實際又沒有被細(xì)菌感染的那些細(xì)胞，只要在實驗中將這部分細(xì)胞清除掉，就可以很好地降低假陽性的風(fēng)險。
訓(xùn)練有素的生物學(xué)家在解決技術(shù)問題時，會去思考實驗背后的生物化學(xué)原理。
周平心想，細(xì)菌粘附在細(xì)胞表面，本質(zhì)上是細(xì)菌的AFA蛋白與細(xì)胞膜上的CD55之間的非共價相互作用。假若能在細(xì)菌侵染之后、細(xì)胞分選之前增加一步特殊處理，破壞AFA與CD55之間的作用，洗脫細(xì)胞表面粘附的細(xì)菌，是不是就可以通過細(xì)胞中細(xì)菌熒光蛋白的信號作為分界線消除這部分來自假陽性細(xì)胞的干擾呢？
于是，周平嘗試了一系列能使蛋白質(zhì)變性的物質(zhì)，最終發(fā)現(xiàn)，乙醇處理能顯著降低假陽性細(xì)胞的比例。
2016年4月1日，經(jīng)歷了一年多反復(fù)的試錯，周平博士打開了第五輪優(yōu)化篩選的測序分析結(jié)果——篩選質(zhì)量極高，異源自噬通路已知的陽性對照基因紛紛從兩萬多個基因中被拎出了隊伍。篩選總共發(fā)現(xiàn)了87個候選基因可能與異源自噬通路相關(guān)。
他們欣喜地感受到，身邊足足糾纏了兩年的濃霧終于稍有消散，露出了一些可以繼續(xù)前進(jìn)的道路。
圖4. 艱難的CRISPR遺傳篩選。為了找到宿主細(xì)胞中參與異源自噬的基因，周平博士開展了一個全基因組的遺傳學(xué)篩選。由于所要回答科學(xué)問題的特殊性，這個遺傳篩選體系的建立經(jīng)歷了很多波折。
花明（2016.4-2016.12）
許悅和周平在得到遺傳篩選結(jié)果后做的第一件事，就是驗證篩選的結(jié)果，他們針對每一個候選基因單獨設(shè)計了多條gRNA，同時與Cas9蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞，快速檢驗敲除該基因是否能重現(xiàn)篩選的表型，即是否會下調(diào)異源自噬水平。測驗的結(jié)果是，大多數(shù)的小道都是死胡同，單獨敲除該基因沒有表型。
除了已知陽性對照基因以外，只剩下五個基因結(jié)果可被重復(fù)：ATP6AP1, ATP6AP2, ATP6V1F, ATP6V0C, ATP6V1H。
這五個基因其實都是編碼是細(xì)胞中同一個復(fù)合物的組成亞基，而這個復(fù)合物則是一個在生物化學(xué)領(lǐng)域名氣非常大的蛋白——V-ATPase。
V-ATPase是一個蛋白復(fù)合物，就像是一臺離子泵，通過水解ATP分子獲得轉(zhuǎn)動的能量，將氫離子從氫離子濃度低的細(xì)胞質(zhì)泵到濃度較高的膜泡中。
但對于V-ATPase復(fù)合物可能參與異源自噬過程的這個發(fā)現(xiàn)，許悅卻感到喜憂參半。
喜的是，可靠的遺傳篩選結(jié)果加上一連串跟進(jìn)的驗證實驗，她對于V-ATPase在異源自噬事件中的必要性成竹在胸，這一點此前從未有人報道過；憂的是，V-ATPase是一個對細(xì)胞生存至關(guān)重要的膜蛋白復(fù)合物，研究起來技術(shù)上存在很大的挑戰(zhàn)。此外，在機(jī)制上如何能將V-ATPase從其眾多功能中區(qū)分出來，與異源自噬聯(lián)系在一起，她還沒有一點頭緒。
茨威格在《人類群星閃耀時》中曾寫道，在某一個特定瞬間，一個人會被歷史的進(jìn)程推到一個特別的地方，在那里見到前人不曾見過的壯麗景色。茨威格寫這句話的背景，是在形容橫穿美洲大陸看到一望無際的太平洋時刻的探險家巴爾博亞，以及一夜天才寫出不朽杰作《馬賽曲》的魯日。
但在科學(xué)探索的道路上，經(jīng)過艱苦跋涉、沖破重重險阻之后，忽然的靈光一現(xiàn)，將過往的數(shù)據(jù)整合在一起、將邏輯鏈條串聯(lián)通順的剎那，大腦中仿佛一道閃電劃過漆黑的夜空，一切都變得豁然開朗，研究者從中收獲的快樂和滿足可能不遜于茨威格筆下那些英雄們。
2016年5月的一天，許悅在分析一份新鮮出爐的質(zhì)譜數(shù)據(jù)時，就經(jīng)歷了類似于兩千多年以前一位古希臘先哲高呼“Eureka”的高光時刻。
早在2015年年初周平開始摸索CRISPR遺傳篩選條件的同時，許悅沒有停下探索的腳步。基于當(dāng)時已有的線索，她在人細(xì)胞系上構(gòu)建出多個和自噬相關(guān)的基因敲除細(xì)胞系，并嘗試借此探究哪些基因可能參與到異源自噬的過程。在自噬通路中的ATG16L1基因敲除與截短體回補(bǔ)實驗中，她發(fā)現(xiàn)ATG16L1的WD40結(jié)構(gòu)域參與異源自噬過程，但對于經(jīng)典自噬通路不重要。不過這個發(fā)現(xiàn)沒有讓課題有突破性進(jìn)展，因為經(jīng)過反復(fù)的實驗，沒有結(jié)果將SebX與ATG16L1聯(lián)系在一起。
在確認(rèn)V-ATPase參與到異源自噬之后，許悅試圖通過在V-ATPase結(jié)合的蛋白中尋找一點繼續(xù)做下去的草蛇灰線。她嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卦O(shè)計了平行對照與實驗組，選取其中一個亞基進(jìn)行免疫共沉淀。當(dāng)拿到質(zhì)譜結(jié)果時，許悅掃了一下清單，豐度最高的蛋白都是V-ATPase復(fù)合物中的成分，這都在預(yù)料之中。但隨著清單的下拉，她的視線突然定格在了 “ATG16L1”，想不到這個熟悉的蛋白竟會在細(xì)菌感染的實驗組中出現(xiàn)。在確認(rèn)ATG16L1在陰性對照組渺無蹤跡之后，一陣狂喜涌上心頭——是了，眾里尋他千百度，聯(lián)系V-ATPase與異源自噬之間的關(guān)鍵蛋白原來就是ATG16L1！邏輯鏈條上關(guān)鍵的一環(huán)終于被扣上了。
圖5. 激動人心的Eureka時刻。當(dāng)許悅看到這一質(zhì)譜結(jié)果時，立刻想通了V-ATPase與自噬通路的聯(lián)系。ATG16L1僅在病原體自噬通路激活的細(xì)胞中可以被V-ATPase富集檢測到，說明V-ATPase很可能是通過ATG16L1觸發(fā)了病原體自噬通路。
接下來的兩個月里，許悅一鼓作氣，最終論證出ATG16L1利用WD40結(jié)構(gòu)域與V-ATPase復(fù)合物發(fā)生直接相互作用。
還記得在剛剛找到SebX時許悅曾試圖尋找它的酶活性質(zhì)但始終毫無進(jìn)展嗎？
這條道路的探索此時也出現(xiàn)了一點新的眉目。
在許悅和周平在忙乎著優(yōu)化CRISPR遺傳篩選的同時，與邵峰實驗室長期合作的中科院生物物理所的副研究員丁璟珒博士主動請纓，試圖解析SebX的結(jié)構(gòu)。一個神來之筆的截短改變，幫助丁璟珒博士成功獲得了SebX的晶體，并在2016年的年底解出了SebX晶體結(jié)構(gòu)。SebX的結(jié)構(gòu)提示它可能是一個ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶。很快許悅也通過體外的實驗檢測到了SebX能促進(jìn)NAD+的水解，說明SebX極有可能具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，支持基于結(jié)構(gòu)作出的推測。
到了2016年底，博士五年級的許悅幾乎收集齊了講出一個震驚整個異源自噬領(lǐng)域故事的全部資料。
此時，距離整個故事邏輯鏈條的完善，只差一塊拼圖。
2016年底的許悅斗志昂揚(yáng)，士氣高漲。那時的她絕不會想到，為了這最后一塊拼圖的嵌入，她將在接下來的將近兩年里繼續(xù)經(jīng)歷煎熬。
許悅?cè)绾握业阶詈笠粔K關(guān)鍵的拼圖？請看另一篇文章。
科研論文的發(fā)表，是對科研工作者辛勤努力的豐厚獎賞，但其中也充滿了遺憾：當(dāng)代科研論文為了保證邏輯的通順，發(fā)表時的行文順序與研究者實際開展研究的順序往往大相徑庭——對于作者來說，論文中一句簡簡單單的過渡，背后可能藏著道不盡的嘔心瀝血與辛酸苦澀；而對于讀者，閱讀一篇邏輯縝密的科學(xué)論文，固然能高效地獲取相關(guān)領(lǐng)域的最新知識，但同時卻錯過了論文背后作者在探索未知道路上摸爬滾打的歷程，實在是極大的損失。
“科研外史”系列文章希望能在論文作者和讀者之間搭建一個橋梁，讓作者有機(jī)會在這里分享科研路上看到奇?zhèn)ス妍惥吧珪r的那份歡喜，以及在實驗陷入停滯時內(nèi)心跌入深淵谷底的絕望與掙扎；對于讀者，了解論文發(fā)表背后曲折的探索故事，一方面能從作者克服困難的經(jīng)驗中學(xué)習(xí)，積累科學(xué)研究的方法論，在未來自己遇到類似困難時能有更出色的應(yīng)對。但更重要的是，希望借助“科研外史”系列，讀者們能夠從一篇篇優(yōu)雅精致的論文背后，看到一個個有血有肉的科學(xué)家——他們有著自己的喜怒哀樂，在課題有進(jìn)展時會感到喜悅，在遇到瓶頸時會失望郁悶。他們平凡，可能只是等車時我們身邊的一個普通路人；他們卓越，是因為在某一些特別的時刻，正是他們堅忍不拔、永不言敗的精神，開拓著全人類自然科學(xué)知識的邊疆。
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