真相還是假象？神經(jīng)所楊輝CELL論文再遭質(zhì)疑
2020年4月，中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所研究員楊輝課題組在Cell 上發(fā)表研究論文。2020年7月，美國(guó)加州大學(xué)付向東教授舉報(bào)楊輝“ “剽竊和涉嫌造假等學(xué)術(shù)道德不端行為”。造成中國(guó)國(guó)內(nèi)學(xué)術(shù)界軒然大波。一波未平，一波又起，2021年2月1日，美國(guó)哈佛大學(xué)、霍普金斯大學(xué)等校教授（包括美國(guó)科學(xué)院院士）公開(kāi)發(fā)表文章，提出多種質(zhì)疑。海內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家在本文發(fā)表公開(kāi)意見(jiàn)。
獨(dú)家探爭(zhēng)議｜上海學(xué)術(shù)新星遭舉報(bào)，審稿人現(xiàn)身稱(chēng)曾拒稿
楊輝再發(fā)聲明：沒(méi)有及時(shí)交流工作進(jìn)展，深表歉意
付向東首次回應(yīng)：與神經(jīng)所楊輝論文爭(zhēng)議始末
2020年7月，一封舉報(bào)信在網(wǎng)上流出。加州大學(xué)圣地亞哥分校細(xì)胞和分子醫(yī)學(xué)系教授付向東實(shí)名向中科院、科技部、基金委舉報(bào)中科院神經(jīng)所研究員楊輝，稱(chēng)其有 “剽竊和涉嫌造假等學(xué)術(shù)道德不端行為”。被質(zhì)疑的楊輝的論文于2020年4月30日發(fā)表在Cell 上。
此后，付向東向《知識(shí)分子》確認(rèn)，在與神經(jīng)所溝通，希望提供DNA引物訂單證據(jù)無(wú)果后，確實(shí)投遞了這封舉報(bào)信。盡管楊輝也通過(guò)其他媒介作出了回應(yīng)，但付向東卻認(rèn)為 “明顯避重就輕、文過(guò)飾非”。言外之意，沒(méi)有正面回應(yīng)他的質(zhì)疑。
數(shù)月過(guò)后，當(dāng)兩人的爭(zhēng)議漸趨平靜時(shí)，神經(jīng)再生領(lǐng)域的多位專(zhuān)家卻依然發(fā)表文章，懷疑楊輝的那篇Cell 論文中看到的可能是假象，部分結(jié)論需要獨(dú)立的重復(fù)檢驗(yàn)。
那么，疑點(diǎn)在哪呢？
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在最常見(jiàn)的三種視網(wǎng)膜疾病中，老年黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變會(huì)導(dǎo)致作為光感受器的視桿和視錐細(xì)胞喪失；青光眼會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失。這三種視網(wǎng)膜神經(jīng)元的丟失造成了大部分不可逆轉(zhuǎn)的眼盲。單在美國(guó)，這三種疾病共折磨了近1500萬(wàn)人，并且隨著人口老齡化，其患病率也在增加。
那么，如果有療法可以讓這些丟失的視網(wǎng)膜神經(jīng)元再生，就有很重要的臨床意義。
2020年4月，澳門(mén)科技大學(xué)教授張康和付向東等合作發(fā)表文章，在敲低視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞穆勒（Müller）細(xì)胞的某種蛋白質(zhì)PTBP1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)穆勒細(xì)胞轉(zhuǎn)變成了視錐細(xì)胞，且視錐參與的光反應(yīng)顯著恢復(fù)。
緊接著4月30日發(fā)表的楊輝Cell 論文，用了不同的技術(shù)手段，同樣敲低了穆勒細(xì)胞中同一個(gè)PTBP1的表達(dá)，卻將穆勒細(xì)胞轉(zhuǎn)化為了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
2021年2月1日出版的The Journal of Clinical Investigation 上，發(fā)表了約翰霍普金斯大學(xué)教授 Seth Blackshaw 和哈佛大學(xué)教授 Josh Sanes 的觀點(diǎn)文章（以下簡(jiǎn)稱(chēng)JCI文），二人在考察了最近出現(xiàn)的一些看起來(lái)很 “給力” 的研究后，發(fā)現(xiàn)不少矛盾之處，其中就涉及到上述兩篇研究，作者指出——
都是一樣敲低了視網(wǎng)膜穆勒細(xì)胞中PTBP1的表達(dá)，穆勒細(xì)胞卻轉(zhuǎn)化成了不同類(lèi)型的神經(jīng)元——一個(gè)是視錐細(xì)胞，一個(gè)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，這種不同需要解釋。
Blackshaw和Sanes都是研究視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育、損傷和再生的資深專(zhuān)家，后者是美國(guó)科學(xué)院院士。
事實(shí)上，除了JCI文指出的這點(diǎn)不同，付向東于2020年6月24日發(fā)表的Nature 論文的部分結(jié)論和楊輝這篇Cell 論文更有著直接的矛盾。
比如，付向東是通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低PTBP1基因表達(dá)，在帕金森小鼠中腦的黑質(zhì)致密部，把星型膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成了多巴胺能神經(jīng)元，并進(jìn)一步投射到紋狀體。
而楊輝則是通過(guò)基因編輯技術(shù)，敲低PTBP1基因表達(dá)，直接在帕金森小鼠腦中的紋狀體區(qū)域，把星型膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成了多巴胺能神經(jīng)元。
然而，除了在中腦外，付向東還在其它腦區(qū)多做了些驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞中敲降PTBP1并不能夠再生出多巴胺能神經(jīng)元。
這與楊輝的結(jié)論直接沖突。
“紋狀體里95%都是GABAergic神經(jīng)元，所有有轉(zhuǎn)分化的文章得到的都是這類(lèi)的神經(jīng)元，只有加了多巴胺能神經(jīng)元特有的因子才能得到一定量的多巴胺能神經(jīng)元。有經(jīng)驗(yàn)的人一眼就能看出楊輝的細(xì)胞都是些死細(xì)胞。大家都知道抗體很容易附著在死細(xì)胞上，因而得出不合常理的結(jié)論?！?付向東向《知識(shí)分子》表示。
楊輝的結(jié)果也讓另外一些神經(jīng)科學(xué)家感到驚訝。
“紋狀體內(nèi)的神經(jīng)元主要都是GABAergic的（神經(jīng)元），在這樣的微環(huán)境下，紋狀體的膠質(zhì)細(xì)胞理論上變成GABAergic神經(jīng)元的可能性會(huì)比較大。如果要變成多巴胺神經(jīng)元，我想應(yīng)該需要一些特定的因子來(lái)推動(dòng)。” 暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院教授陳功告訴《知識(shí)分子》。
他還進(jìn)一步表示， 如果在紋狀體里再生了多巴胺神經(jīng)元，應(yīng)該深入了解這些本來(lái)不存在的、突然出現(xiàn)的多巴胺神經(jīng)元，是否可能會(huì)對(duì)紋狀體的局部神經(jīng)環(huán)路、乃至更廣泛的大腦神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)生不良影響。
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除了這些直接的矛盾，楊輝的論文還有其他令人驚訝的地方。
在他的論文中，不僅穆勒細(xì)胞轉(zhuǎn)化為了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，且新生的細(xì)胞軸突也能夠迅速通過(guò)視神經(jīng)投射到外側(cè)膝狀體核（LGN）和上丘（SC）并修復(fù)了模型動(dòng)物損傷的視覺(jué)功能。
JCI文的作者提醒到，成年哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜當(dāng)中的軸突化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的再生效率是比較低的，且再生軸突的數(shù)量也是很有限的，也很少會(huì)達(dá)到中央目標(biāo)（central targets）。
“軸突生長(zhǎng)和其它中間狀態(tài)相比，時(shí)間更長(zhǎng)，應(yīng)該比較容易觀察并記錄下來(lái)。對(duì)長(zhǎng)距離軸突投射神經(jīng)元來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生新的神經(jīng)元只是功能恢復(fù)的第一步，后期軸突生長(zhǎng)，導(dǎo)向，突觸形成，和髓鞘形成每一步都必不可少。” 約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授周峰泉告訴《知識(shí)分子》，在軸突再生領(lǐng)域，如何在成年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中（缺少許多發(fā)育過(guò)程中的導(dǎo)向因子和支持的外部環(huán)境）正確導(dǎo)向再生的軸突回到原來(lái)的靶點(diǎn)仍然是一個(gè)難題。
而在2020年12月發(fā)表在 The FEBS Journal 的綜述文章中，周峰泉認(rèn)為，楊輝論文中新產(chǎn)生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突生長(zhǎng)太快了，數(shù)量也太多了，他在論文中具體闡述道——
“在兩周內(nèi)，楊輝研究新產(chǎn)生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突就從外核層（ONL）一直長(zhǎng)到中腦的上丘，每周生長(zhǎng)7.5毫米，而大多數(shù)的軸突再生研究，四周后才達(dá)到視交叉，每周只長(zhǎng)1毫米，且到了視交叉的大多數(shù)再生軸突都找不到目標(biāo)腦核的路途；此外，在另外一項(xiàng)遵循細(xì)胞移植策略的研究中，在所有移植的具有高度再生能力的P0小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，只有極少數(shù)能實(shí)現(xiàn)軸突再生，那些確實(shí)能延伸出軸突的，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層移植3周后，只有非常有限的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞把軸突延伸至了視網(wǎng)膜視神經(jīng)的出口，離視交叉和上丘還差很遠(yuǎn)?！?/span>
付向東則認(rèn)為，楊輝的工作認(rèn)為視神經(jīng)可以以正常發(fā)育十倍的速度生長(zhǎng)，“完全違背科學(xué)常識(shí)?！?/span>
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這些相互矛盾、甚至有反常識(shí)的現(xiàn)象如何解釋?zhuān)磕z質(zhì)細(xì)胞到底是不是真的轉(zhuǎn)化成了神經(jīng)元？
在考察了當(dāng)前涌現(xiàn)的諸多神經(jīng)原位再生的研究后，JCI文的兩位作者、周峰泉等業(yè)內(nèi)不少專(zhuān)家都意識(shí)到，要排除假象，需要做更多的檢驗(yàn)以完善證據(jù)鏈條。
首要面對(duì)的是 “泄漏” 的問(wèn)題。
我們的大腦，比如視網(wǎng)膜，主要有兩類(lèi)細(xì)胞，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)總的目標(biāo)是把部分膠質(zhì)細(xì)胞變成神經(jīng)元，流行的方法是用病毒把某種工具包（包括啟動(dòng)子）專(zhuān)一性的遞送到膠質(zhì)細(xì)胞里進(jìn)行干預(yù)（比如過(guò)表達(dá)或者敲除某個(gè)基因），為了跟蹤這些膠質(zhì)細(xì)胞，工具包里也會(huì)帶熒光蛋白基因。這樣，原則上就可以看哪些膠質(zhì)細(xì)胞真的變成了神經(jīng)元。
但理想和現(xiàn)實(shí)存在差距，實(shí)際中，某些工具包的設(shè)計(jì)并不能保證僅僅對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行操作或標(biāo)記。
”這個(gè)意思就是，你以為你設(shè)計(jì)的反應(yīng)是應(yīng)該百分百在膠質(zhì)細(xì)胞里面進(jìn)行的，但實(shí)際上不完全是，而且當(dāng)你用的病毒滴度越高，這種反應(yīng)越可能會(huì)在神經(jīng)元里面進(jìn)行，所以如果你使用了過(guò)量的病毒，就有可能直接在神經(jīng)元里面看到原本應(yīng)該在膠質(zhì)細(xì)胞里表達(dá)的熒光蛋白，這樣你以為看到了轉(zhuǎn)變后的新神經(jīng)元，但也許只是原來(lái)的神經(jīng)元。” 陳功解釋說(shuō)。
就泄漏而言，周峰泉認(rèn)為，楊輝等人實(shí)驗(yàn)中用的AAV病毒、GFAP啟動(dòng)子，特異性都成問(wèn)題。
“首先使用的AAV病毒本身就會(huì)感染視網(wǎng)膜內(nèi)的不同種類(lèi)細(xì)胞，包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）和膠質(zhì)細(xì)胞（如穆勒細(xì)胞）。同時(shí)，特異性針對(duì)穆勒膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因編輯主要是通過(guò)使用GFAP膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，但GFAP啟動(dòng)子膠質(zhì)細(xì)胞特異性并不是100%可靠。含GFAP啟動(dòng)子的基因也可能在神經(jīng)元細(xì)胞里表達(dá)。” 他說(shuō)。
不過(guò)，陳功也提醒，泄漏的存在并不應(yīng)該把膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的可能性徹底否定掉。
在具體實(shí)踐中，他的團(tuán)隊(duì)和國(guó)際上許多其他團(tuán)隊(duì)曾使用逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)證明膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，原因是逆轉(zhuǎn)錄病毒只會(huì)針對(duì)分裂型的膠質(zhì)細(xì)胞，不會(huì)泄漏到不分裂的神經(jīng)元里。他的團(tuán)隊(duì)還運(yùn)用膠質(zhì)細(xì)胞譜系示蹤小鼠證明了事先標(biāo)記示蹤的膠質(zhì)細(xì)胞確實(shí)可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。
“所以，一定要全面客觀地評(píng)價(jià)原位神經(jīng)再生這一新技術(shù)，不能因?yàn)橛腥俗鲥e(cuò)了實(shí)驗(yàn)就把整個(gè)領(lǐng)域一棍子打死。” 他說(shuō)。
作為該領(lǐng)域的先行者，陳功也曾發(fā)表文章對(duì)一些評(píng)論進(jìn)行了澄清。在他看來(lái)，AAV 雖然有泄漏現(xiàn)象，但是只要把滴度降的比較低，是可以把泄漏比例降的很低——
“我們通常推薦用1x108-10GC/ml的滴度把假陽(yáng)性的比例降到5%或者更低。有些實(shí)驗(yàn)室使用了過(guò)高量的AAV，比如超過(guò)1x1013GC/ml的滴度，這種高滴度所造成的假陽(yáng)性值得關(guān)切。有些實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要第三方驗(yàn)證?！?/span>
然而，奇怪的是，盡管楊輝的Cell論文使用的不同AAV都是1013的 “高” 滴度，竟然沒(méi)有觀察到任何的泄漏。
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另外一個(gè)說(shuō)明確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)化的方法是證明中間態(tài)的存在。
試想一下，膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)細(xì)胞不可能是瞬間發(fā)生的，一定經(jīng)歷了某種中間過(guò)程和狀態(tài)——細(xì)胞的形態(tài)可能發(fā)生變化，細(xì)胞的位置正逐步遷移，細(xì)胞內(nèi)部分子和功能也逐步變化。
而在之前的舉報(bào)信中，付向東曾指出楊輝Cell 論文缺乏轉(zhuǎn)變的中間狀態(tài)——
“楊輝的這篇《細(xì)胞》論文在4月份在線發(fā)表后，許多神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的專(zhuān)家隨即對(duì)其數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性提出了一系列質(zhì)疑，指出論文并沒(méi)有確鑿的證據(jù)證明誘導(dǎo)新產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞所必經(jīng)的細(xì)胞遷移、漸近的細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)轉(zhuǎn)變以及新獲得的神經(jīng)電生理特性等等。通俗地說(shuō)，由于沒(méi)有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程的系列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，很難說(shuō)他們的結(jié)論真實(shí)可靠，不能排除他們看到的陽(yáng)性結(jié)果是出于實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)假象。”
付向東認(rèn)為，支持楊輝結(jié)論的大多數(shù)證據(jù)， 很有可能是由于GFAP-CRE在內(nèi)源神經(jīng)元中的泄漏表達(dá)所致。
那么，如何做才能讓人信服？
“就好像一個(gè)人坐電梯從10樓下到1樓，總要一層層下，不會(huì)一下子就跳到一樓了。我們團(tuán)隊(duì)在小鼠和獼猴的大腦皮層里，都觀察到了星型膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的中間態(tài)，也就是轉(zhuǎn)化早期的細(xì)胞既有部分膠質(zhì)細(xì)胞的屬性又有神經(jīng)元的部分屬性，這種中間態(tài)的存在是細(xì)胞之間轉(zhuǎn)分化的強(qiáng)有力的證據(jù)，” 陳功解釋說(shuō)。
周峰泉也建議，應(yīng)盡可能密集地捕捉轉(zhuǎn)變的中間狀態(tài)——
比如，視網(wǎng)膜中穆勒膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布在不同的層，轉(zhuǎn)變意味著，穆勒膠質(zhì)細(xì)胞要一步步 “爬” 到目的地，且細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)錄組要經(jīng)歷逐步的變化（單細(xì)胞測(cè)序可以用于做這樣的分析）；最終，新轉(zhuǎn)變成的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，需要進(jìn)一步追蹤其軸突生長(zhǎng)，準(zhǔn)確的投射到相應(yīng)的腦區(qū)并發(fā)揮正常功能（當(dāng)前腦組織清洗和深度3D影像技術(shù)都可以做這樣的觀察）。
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質(zhì)疑和批評(píng)是科學(xué)的常態(tài)，也是進(jìn)步的源泉，尤其是在面對(duì)紛繁復(fù)雜的新興領(lǐng)域的時(shí)候。很多時(shí)候，區(qū)分事實(shí)和假象并不容易，但“如實(shí)報(bào)告”是應(yīng)有的基本規(guī)范和底線。
盡管有各種可供批評(píng)之處，不少研究都聲稱(chēng)緩解或者治療了動(dòng)物模型的某種神經(jīng)疾病。顯然，基礎(chǔ)研究的結(jié)果越可靠，就越有利于后期的臨床轉(zhuǎn)化。楊輝等人報(bào)道的 “誘人” 結(jié)果，無(wú)論是治療神經(jīng)性眼盲還是帕金森，引發(fā)更大范圍的關(guān)注自然也不奇怪，如果是一項(xiàng)不重要的結(jié)果，也很少會(huì)有人爭(zhēng)搶。
同樣也面臨JCI一文質(zhì)疑的張康向《知識(shí)分子》表示，“選擇四月齡甚至更大的rd10小鼠，已經(jīng)檢測(cè)不到感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜電圖信號(hào)，再結(jié)合GFAP-CRE追蹤系統(tǒng)，我們認(rèn)為后形成的感光細(xì)胞和功能由穆勒膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)”。
他也同時(shí)承認(rèn)，后期需要完善體內(nèi)追蹤系統(tǒng)，包括使用更長(zhǎng)或全長(zhǎng)GFAP啟動(dòng)子、double cre，設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照組，足夠密集的取樣時(shí)間點(diǎn)和全面的分析手段，逐級(jí)追蹤穆勒膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程，對(duì)形成的細(xì)胞進(jìn)行全面的分析，以證明所看到的神經(jīng)細(xì)胞真的由穆勒膠質(zhì)細(xì)胞而來(lái)。
付向東就此也向《知識(shí)分子》表示，對(duì)于JCI文質(zhì)疑，他們正設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)全面解決AAV泄漏的問(wèn)題。
截止發(fā)稿時(shí)，楊輝沒(méi)有回應(yīng)《知識(shí)分子》的電郵詢問(wèn)。
“我相信如此拉風(fēng)的研究一定會(huì)有人重復(fù)，只有重復(fù)才能做出最終的判斷?！?陳功說(shuō)。
