饒毅：三十年前做基因測序和“基因治療”
? 當年的實驗記錄本
導讀：
1988年2月22日，我對自己新發(fā)現(xiàn)的基因開始準備進行基因測序，這一工作遇到困難，終于在1988年8月8日完成。
其后，我做了轉(zhuǎn)基因，將我克隆和分析過的DNA導入動物體內(nèi)，它可以“治療”動物腦發(fā)育的“疾病”。
撰文 | 饒 毅（《知識分子》主編、北京大學教授）
責編 | 葉水送
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1985年的秋天，我到美國舊金山加州大學（UCSF）做研究生，第一個學期的第一個研究在神經(jīng)生物學計劃主任Zach Hall的實驗室輪轉(zhuǎn)。在那里，我做了一生第一次的DNA實驗：將一段DNA切下轉(zhuǎn)到另外一個載體。第一次見到DNA，我很激動，此前我在中國讀過文章，但沒有做過DNA實驗。那時，誰如果克隆一個新基因的DNA已是了不得，等到1991年我研究生畢業(yè)時，克隆基因雖然還重要到可以上Nature雜志，但已經(jīng)不如最初那么顯眼，而需要看克隆的基因有多重要、克隆過程有多難。
1986年至1987年，我在實驗室的工作很不順利。
? C13b CDNA測序記錄
1987年，我的課題走上軌道，我研究一個控制果蠅神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基因big brain（bib），這一基因突變后，果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)增加，表皮減少，這是因為早期發(fā)育中前體細胞要決定成為神經(jīng)細胞還是表皮細胞，bib基因產(chǎn)物參與了這一調(diào)控環(huán)節(jié)。bib基因的突變由德國科學家首先發(fā)現(xiàn)，但沒人得到bib基因的DNA序列（簡稱克隆基因）。
1987年，我在詹裕農(nóng)、葉公杼實驗室，因為有轉(zhuǎn)座子P因子插入bib基因的果蠅突變種，所以可用分子生物學的方法很快拿到bib基因及其附近區(qū)域的DNA，然后從前人積累的幾個品系的bib基因突變種中取得它們的DNA，檢查它們分別在哪里有DNA變化，從而推測bib基因的DNA是哪一段。這與人類遺傳疾病的致病基因研究方法在原理上是一樣的，但果蠅更好分析，因為可隨研究者的意愿進行各種交配。當然在人里面不能按研究者的安排來雜交，只能接受現(xiàn)實，所以分析麻煩些，但本質(zhì)相同。
1987年，我拿到了含bib基因的基因組DNA（genomic DNA，gDNA），然后用它做探針，篩選互補DNA文庫（complementary DNA，cDNA）。cDNA是科學家通過用體內(nèi)的信使RNA（messenger RNA，mRNA）進行逆轉(zhuǎn)錄，得到與mRNA序列互補的cDNA，建成雙鏈DNA的文庫，便于擴增和使用。我也很快找到了bib基因的cDNA，以后用的克隆碰巧是第13號，我稱之為c13，它不長，只有3.4 kb（3400個堿基對）。
在得到c13的cDNA后，應該可以很快進行序列分析（DNA測序）。但是因為一個技術(shù)環(huán)節(jié)的問題，我從1988年2月22號到6月26號來回兜圈，可謂氣惱。DNA測序不能線性、一次順序檢測，而需要一段一段（一般幾百堿基對的長度）。為了保證這一段一段有次序，一個巧妙的方法是從一個長的DNA一端開始，做順序性的切除，這樣每一個切除后的產(chǎn)物比前面一個短一些，從同一端測序的話就正好相當于一段一段地測序。這個方法聽起來很簡單，特別是當有人發(fā)明這一方法之后，但里面有個小的技術(shù)環(huán)節(jié)，進行順序切割的外切酶只要DNA有缺口就繼續(xù)切，而一般制備的DNA常常有缺口，需要用CsCl（氯化銫）中超速離心的DNA（專業(yè)詞匯是CsCl banding）才能把沒有缺口的優(yōu)質(zhì)DNA與其他分開，這一細節(jié)當時不是所有人都記得，因為此前DNA常規(guī)都用超速離心機進行CsCl分層，而小型離心機當時是很新的應用，小型離心機的DNA對一般很多實用是可以用的，但含缺口，就會碰到外切酶到處切的問題，得到的DNA就不是順序的，而是亂七八糟的。這個小的細節(jié)讓我浪費了四個月的時間，最后有人提醒，一經(jīng)改變，馬上就順利了。
? Sanger測序的典型結(jié)果（這張是原始結(jié)果之一，不過不是我研究生期間的，很可能是九十年代的）
常用的測序法是英國科學家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1977年發(fā)明的，他部分依據(jù)于吳瑞發(fā)明的引物延伸（Primer extension），加上Sanger自己發(fā)明的雙去羥基法。測序的過程要用同位素S35，這不是很大的問題，因其放射性很弱。而測序需要用玻璃板比較長，且需要洗得很干凈，是個體力活：樣本上好之后，需要幾千伏的高壓電泳，一般晚上上樣，隔夜跑電泳，第二天早上以后進行同位素曝光和分析。
1988年8月8日，我的筆記本總結(jié)bib基因的cDNA全部序列分析清楚了。
1987年，我克隆出bib基因，1988年中完成對其DNA序列的分析，此后做了其轉(zhuǎn)基因，將bib的gDNA導入到果蠅中，1988年底得到轉(zhuǎn)基因的果蠅。
我將bib基因裝入含轉(zhuǎn)座子P因子的轉(zhuǎn)基因載體，注入果蠅胚胎中，得到嵌合體，嵌合體的鑒定是通過轉(zhuǎn)基因載體另外所含的導致眼睛顏色變紅的基因（名稱為white，缺乏這一基因的果蠅是白眼，給予white基因后就恢復紅眼）。因為培育出果蠅后還需要交配傳代再鑒定，時間需要幾個月，一直延續(xù)到了年底。我遇到了困局：年底還要不要出去旅游，去不去亞利桑那州的大峽谷。
想想轉(zhuǎn)基因果蠅的特點，我可以做到工作、旅游兩不誤。把果蠅帶在車上，照樣去亞利桑那州的Tucson，當時梅林在亞利桑那大學念研究生。
這個實驗比較容易，只要在簡單顯微鏡下看看有紅眼果蠅，就知道拿到了轉(zhuǎn)基因果蠅，從而挑出它們與野生型的果蠅交配就可以了。實驗需要很簡單，所以帶著它們在其他地方也可以做，事實上，多半時間是等果蠅交配、出生以及長大，偶爾才看看它們是否有紅眼。
在旅行途中，我得到的攜帶bib轉(zhuǎn)基因果蠅，以后帶回舊金山，在實驗室進一步實驗證明，bib缺陷的果蠅有神經(jīng)增加、表皮減少的表型，而通過轉(zhuǎn)基因?qū)胛宜寺〉?em>bib gDNA后，可挽救這一表型，完全證明所克隆的DNA確實就是bib基因。
在低等動物中，我們要求證明拿到一個基因需要分析突變種在一段DNA有缺陷、也可以通過重新導入這段DNA而挽救表型，來證明是否拿到了正確的基因。在人身上，長期做不到這一點。但是，2017年人類基因治療的技術(shù)有所突破，可能可以趕上果蠅的研究。
如果要用擬人的方式類比，我當初拿到bib基因的過程其實就像分析人類遺傳疾病，該基因可導致果蠅腦發(fā)育異常，我們對其進行分析，獲得DNA序列，確定哪段參與特定腦發(fā)育疾病的基因。而后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導入這段DNA，挽救突變果蠅的腦發(fā)育表型，這就是一種基因治療。當然，對人的基因治療一般是體細胞治療，我自己不贊成人類的性細胞基因治療，但支持人類體細胞的基因治療。
制版編輯： 常春藤｜
